Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo
Summary
Este manuscrito describe un protocolo para la proyección de imagen en vivo de la retina de ratón con tomografía de coherencia óptica de alta resolución de dominio espectral (SD-OCT). Se centra en las células ganglionares de la retina (RGC) en la región de pepipapilar, con varios análisis y cuantificación de enfoques descritos.
Abstract
Cambios estructurales en la retina son manifestaciones comunes de enfermedades oftálmicas. Tomografía de coherencia óptica (OCT) que permite su identificación en vivo— rápidamente, repetidor y con una alta resolución. Este protocolo describe OCT la proyección de imagen en la retina de ratón como una poderosa herramienta para el estudio de neuropatías ópticas (OPN). El sistema de OCT es una alternativa no invasiva, basada en la interferometría a común análisis histológico post mortem . Proporciona una evaluación rápida y precisa del grueso retiniano, lo que permite la posibilidad de cambios, tales como adelgazamiento o engrosamiento retiniano. Presentamos el proceso de proyección de imagen y análisis con el ejemplo de la línea de ratón Opa1delTTAG . Se proponen tres tipos de análisis, con dos métodos de cuantificación: calibradores estándar y caseros. Este último es mejor para el uso en la retina pepipapilar durante exploraciones radiales; siendo más precisos, es preferible para el análisis de las estructuras más finas. Todos los enfoques descritos aquí están diseñados para que las células ganglionares de la retina (RGC), pero son fácilmente adaptables a otras poblaciones de la célula. En conclusión, la OCT es eficiente en fenotipado de modelo ratón y tiene el potencial de ser utilizado para la evaluación confiable de las intervenciones terapéuticas.
Introduction
OCT es una herramienta de diagnóstico que facilita la examinación de estructuras retinianas1, incluyendo la cabeza del nervio óptico (HNO). Con los años se ha convertido en un indicador confiable de la progresión de la enfermedad en los seres humanos2,3, así como en roedores4,5. Utiliza la interferometría para crear imágenes transversales de las capas retinales con una resolución axial de 2 μm. La capa más interna es la capa de fibras nerviosas retinianas (RNFL), que contiene axones RGC, que es seguida por la capa de células ganglionares (GCL), que contienen en su mayoría grave. El siguiente es la capa plexiforme interna (IPL), encuentro de dendritas RGC axones de células bipolares, horizontales y amacrinas. Éstos, junto con las células horizontales, forman la capa nuclear interna (INL), y sus salientes se conectan con axones de fotorreceptor en la capa plexiforme externa (OPL). Esto es seguido por la capa nuclear externa (ONL), con cuerpos de la célula del fotorreceptor y está separada de la capa del fotorreceptor por la membrana limitante externa (OLM), también llamada segmento segmento interno/externo (IS / OS) capa. Finalmente, las últimas capas observables en la retina de ratón son el epitelio retiniano del pigmento (RPE) y la coroides (C). El RNFL solo normalmente es demasiado fina para medirse en ratones; así, analizando la RNFL/GCL es preferible4,5. Otra posibilidad es la capa compleja de GC, que contiene el último además de la IPL, lo que es más grueso y así aún más fácil medir en OCT explora4. En consecuencia, OCT permiten comprender mejor la situación patológica de la retina, como en OPNs.
Por otra parte, el espesor de la retina de ratón se analiza a menudo con la histología post mortem . Sin embargo, esta técnica enfrenta limitaciones relacionadas con la colección de tejidos, fijación, corte, coloración, montaje, etc. por lo tanto, algunos defectos, tales como cambios de espesor sutil, no pueden ser detectado. Por último, porque el mismo ratón no puede ser probado en tiempo varios puntos, el número de animales por estudiar mucho aumento, a diferencia de OCT. Todo, la no invasividad, alta resolución, posibilidad de repetición, control de tiempo en tiempo y facilidad de uso de la tecnología OCT hacen el método de elección en los estudios de la enfermedad retiniana.
Modelos de ratón se utilizan para identificar defectos del gene y para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes de retinopatías6. OPN es una forma de retinopatía con considerable daño al nervio óptico (en), que se compone de axones RGC aproximadamente 1,2 millones. OPN se puede centrar en el o puede ser secundaria a otros trastornos congénitos o no7, llevando a la pérdida de campo visual y más tarde, ceguera. Rasgos característicos de OPN son leve pérdida y daño, que pueden observarse en humano OCT RNFL y GCL adelgazamiento2,3. Mientras tanto, la fisiopatología de la OPN es todavía mal entendida, y por lo tanto, permanece la necesidad de probar la retina de ratón.
Este manuscrito describe la proyección de imagen y cuantificación del espesor de la capa retiniana, usando el ejemplo del Opa1delTTAG ratón línea8,9, un modelo de la atrofia óptica dominante (DOA)10. Evaluar la patofisiología RGC, se cuantificaron exploraciones radiales, rectangulares y anulares. Esto fue hecha con pinzas estándar proporcionadas por el software de OCT o con una macro casera desarrollado para un programa de procesamiento de imágenes de código abierto. Las pinzas estándar son difíciles de manipular y a menudo más grueso que el RNFL/GCL, mientras que las pinzas caseras son más precisos, reproducibles y fáciles de usar. La macro realiza una medición de una capa automáticamente detectada, en 5 puntos y en posiciones fijas, en ambos lados del HNO en la región de pepipapilar. El objetivo del protocolo presentado es describir adquisición de exploración de OCT para especificar posición retiniana, con un enfoque en RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema OCT, un no-invasivo en vivo imagen método, proporciona alta resolución exploraciones de Cruz-section-como retinales. Por lo tanto, su principal ventaja es su potencial para un análisis detallado, con la maravillosa oportunidad de incorporar protocolos habitualmente aplicados a los seres humanos a modelos de ratón.
En el ejemplo de Opa1delTTAG ratones mutantes, SD-OCT resultados mostraron un aumento de espesor de capa compleja de RNFL y GC, que permit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Inserm, Universidad de Montpellier, Francia de Retina, Unión Nacional des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Asociación de síndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France y el laboratorio de excelencia Programa de EpiGenMed.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Referências
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
