Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo
Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för den in-vivo imaging av mus näthinnan med högupplösta spektrala domänen optisk koherenstomografi (SD-okt). Den fokuserar på retinala ganglionceller (RGC) i peripapillary regionen, med flera scanning och kvantifiera metoder beskrivs.
Abstract
Strukturella förändringar i näthinnan är gemensamma manifestationer av oftalmologiska sjukdomar. Optisk koherenstomografi (OCT) gör deras identifiering i vivo— snabbt, upprepande och i hög upplösning. Det här protokollet beskriver OCT imaging i mus näthinnan som ett kraftfullt verktyg att studera fiberoptiska neuropatier (OPN). Systemets OCT är ett interferometri-baserad, icke-invasiva alternativ till vanlig besiktning histologiska analyser. Det ger en snabb och korrekt bedömning av retinal tjocklek, möjlighet att spåra ändringar, till exempel retinal gallring eller förtjockning. Vi presenterar den imaging process och analys med exemplet av raden Opa1delTTAG mus. Tre typer av skanningar föreslås, med två metoder för kvantifiering: standard och hemmagjord bromsok. Det senare är bäst för användning på peripapillary näthinnan under radiella skanningar; att vara mer exakt, är att föredra för att analysera tunnare strukturer. Alla metoder som beskrivs här är designade för retinala ganglionceller (RGC) men är lätt att anpassa till andra cellpopulationer. Sammanfattningsvis, OCT är effektiv i mus modell fenotypning och har potential att användas för tillförlitlig utvärdering av terapeutiska interventioner.
Introduction
OCT är ett diagnostiskt verktyg som underlättar granskningen av retinal strukturer1, inklusive synnervspapillen (ONH). Under åren har det blivit en pålitlig indikator för sjukdomsprogression i människor2,3, liksom i gnagare4,5. Det använder interferometri för att skapa tvärsnittsdata bilder av näthinnans skikt 2 µm axiella upplösning. Det innersta lagret är retinal nerve fiber lager (RNFL), som innehåller RGC axoner, som följs av det ganglion celllagrar (GCL), som innehåller mestadels RGC organ. Nästa är det inre plexiform lagret (IPL), där RGC dendriter möts bipolär, horisontella och amakrina celler axoner. Dessa, tillsammans med horisontella celler, bildar det inre nukleära lagret (INL) och deras utskjutande delar ansluta med ljusmätare axoner i det yttre plexiform lagret (OPL). Detta följs av det yttre nukleära lagret (v), med ljusmätare cell organ, och är separerad från ljusmätare lagret av det yttre begränsande membranet (OLM), även kallad inre segment/yttre segmentet (IS / OS) lager. Slutligen är de sista observerbara lagrarna i mus näthinnan pigmentepitelet (RPE) och åderhinnan (C). RNFL ensam är normalt för tunn för att mätas i möss; analysera de RNFL/GCL istället är alltså att föredra4,5. En annan möjlighet är den GC komplexa lager, som innehåller den senare utöver IPL, gör det tjockare och därmed ännu lättare att mäta på OCT File4. OCT kan följaktligen ge inblick i patologiskt status av näthinnan, såsom i OPNs.
Alternativt, tjockleken på mus näthinnan analyseras ofta med besiktning histologi. Men kan inte denna teknik ansikten begränsningar som rör vävnad samling, fixering, skärning, färgning, montering, etc. därför vissa defekter, såsom subtila tjocklek förändringar, identifieras. Slutligen, eftersom samma mus inte kan testas på flera tid pekar, antalet djur per studera kraftigt ökar, till skillnad från för ULT-länder. Alla, icke-invasivt, högupplöst, möjligheten för repetition, övervakning i tid och användarvänlighet av OCT tekniken gör den metoden för val i näthinnesjukdom studier.
Mus-modeller används för att identifiera genen defekter och att klarlägga molekylära mekanismer bakom retinopati6. OPN är en form av retinopati med verklig skada på synnerven (på), som består av ungefärligt 1.2 miljon RGC axoner. OPN kan inriktas på ON eller kan vara sekundärt till andra sjukdomar, medfödda eller inte7, leder till synfältsbortfall och senare, blindhet. Karakteristiska drag av OPN är RGC förlust och skador, som kan observeras i mänskliga okt som RNFL och GCL gallring2,3. Samtidigt patofysiologin av OPN är fortfarande bristfällig och därmed behovet av att testa musen näthinnor förblir.
Detta manuskript beskriver imaging och kvantifiering av retinal skiktets tjocklek, med exemplet av Opa1delTTAG mus linje8,9, en modell av dominerande Optikusatrofi (DOA)10. För att bedöma RGC patofysiologi, kvantifierades radiell, rektangulär och ringformiga skanningar. Detta gjordes med standard bromsok som tillhandahålls av programvaran OCT eller med en hemmagjord makro som utvecklats för en öppen källkod bild bearbetningsprogram. Standard oken är svåra att manipulera och ofta tjockare än RNFL/GCL, medan hemmagjord oken är lätt att använda, reproducerbar och mer exakt. Makrot utför en mätning för ett automatiskt identifierade lager, i 5 Poäng och på fasta positioner, på båda sidor av ONH i peripapillary regionen. Målet med protokollet presenterade är att beskriva OCT scan förvärv för att ange retinal positionering, med fokus på RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT systemet, en icke-invasiv i vivo imaging metod, ger högupplöst retinal Cross-Country-section-liknande sökningar. Således är dess största fördel dess potential för detaljerad analys, med en underbar möjlighet att införliva protokoll rutinmässigt tillämpas på människor till musmodeller.
I exemplet med Opa1delTTAG muterade möss resultat SD-okt visade en ökning av RNFL och GC komplexa skiktets tjocklek, som möjliggjorde ytterligare utforskning av D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Inserm, Université Montpellier, näthinnan Frankrike, Union National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association Syndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France och laboratorium av förträfflighet EpiGenMed program.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Referências
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
