Aqui, descrevemos a aplicação da recuperação de fluorescência tridimensional após o fotobleaching (3D-FRAP) para a análise do deslocamento dependente da junção de miARN. Em contraste com os métodos comumente aplicados, o 3D-FRAP permite a quantificação da transferência intercelular de pequenos RNAs em tempo real, com alta resolução espaço-temporal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Análise do Gap Junction-dependente Transferência de miARN com 3D-FRAP Microscopia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os pequenos ARNs antisentidos, como o miARN e o siRNA, desempenham um papel importante na fisiologia celular e na patologia e, além disso, podem ser utilizados como agentes terapêuticos no tratamento de diversas doenças. O desenvolvimento de novas estratégias inovadoras para a terapia com miARN / siRNA é baseado em um amplo conhecimento dos mecanismos subjacentes. Dados recentes sugerem que os pequenos RNAs são trocados entre as células de uma maneira dependente da junção de lacunas, induzindo os efeitos reguladores de genes na célula receptora. Técnicas biológicas moleculares e análise citométrica de fluxo são comumente usadas para estudar a troca intercelular de miARN. No entanto, esses métodos não fornecem alta resolução temporal, o que é necessário ao estudar o fluxo juncional de gap das moléculas. Portanto, para investigar o impacto do miARN / siRNA como moléculas de sinalização intercelular, são necessárias novas ferramentas que permitirão a análise desses pequenos RNAs no nível celular. O presente protocolo descreve o apPlicação da recuperação de fluorescência tridimensional após microscopia de fotoblanqueamento (3D-FRAP) para elucidar a troca de moléculas de miARN entre as células cardíacas dependentes da junção gap. É importante ressaltar que esta abordagem direta e não invasiva de imagens de células vivas permite a visualização e quantificação do deslocamento de junção de RNA pequenos com marcação fluorescente em tempo real, com alta resolução espaço-temporal. Os dados obtidos por 3D-FRAP confirmam uma nova via de regulação de genes intercelulares, onde os pequenos RNAs atuam como moléculas de sinalização dentro da rede intercelular.
Introdução
Os pequenos RNAs não codificados são jogadores importantes na regulação de genes celulares. Estas moléculas são compostas por 20-25 nucleótidos que se ligam a um mRNA alvo específico, levando ao bloqueio da tradução ou à degradação mRNA 1 , 2 . O processo de regulação de genes realizado por pequenos RNAs, como o miARN e siRNA, é um mecanismo altamente conservado que foi encontrado em muitas espécies diferentes 3 . Em particular, as moléculas de miARN são de importância crucial para uma variedade de processos fisiológicos, incluindo proliferação, diferenciação e regeneração
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todas as etapas neste protocolo envolvendo ratos neonatais foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado de animais do Centro Médico da Universidade Rostock.
1. Preparação de pratos de cultura de células e do meio para cultura de cardiomiócitos
- Revestir uma placa de cultura de células com 0,1% de gelatina em PBS e incubar a 37 ° C durante 4 h ou a 4 ° C durante a noite. Remova a gelatina e deixe secar sob fluxo de ar laminar esterilizado.
- Prepare o meio de cultura celular composto por 50 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Pré-aqu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Aqui, apresentamos a microscopia 3D-FRAP como uma técnica não-invasiva para estudar o deslocamento juncional do miARN fluorescente nos cardiomiócitos neonatais. Os cardiomiócitos isolados revelaram o típico padrão de α-aletina estriada e continham grandes placas de Cx43 ao longo das bordas das células celulares ( Figura 1A , pontas de flecha brancas), o que permitiu o alto fluxo intercelular de moléculas. A pureza dos cardiomiócitos isolados foi avaliada pel.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Os miRNAs são atores-chave na fisiologia celular e demonstraram que atuam como moléculas de sinalização usando-entre outros - GJs como um caminho para a troca intercelular 11 , 12 , 22 . O protocolo atual apresenta uma técnica de imagem de células vivas in vitro para caracterizar esta rodovia dependente de GJ usando miARNs fluorescentes dentro dos clusters celulares.
O protocolo foi d.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa da Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o Estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com Fundos Estruturais da UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), o DFG (DA1296-1) e a Fundação Alemã do Coração (F / 01/12). Além disso, o RD é suportado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade Rostock (889001), a Fundação DAMP e o BMBF (VIP + 00240).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| camundongos NMRI neonatais | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0,1% solução em PBS, PBS esterilizado |
| Pan Biotech | P04-53500 | ||
| Dulbecco&agudo; s meio modificado | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µ g/mL |
| Soro bovino fetal | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Plástico de cultura celular | TPP | ||
| Kit de isolamento de cardiomiócitos primários | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | incluído no kit de isolamento de cardiomiócitos primários |
| Azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| microRNA marcado com miRIDIAN Dy547 Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve em água livre de RNAse, solução estoque 20µ M |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma | S3139 | |
| Fosfato de sódio dibásico | Carl Roth | T877.2 | |
| Cloreto de potássio | Sigma | P9333 | |
| Cloreto de magnésio | Serva | 28305.01 | |
| Succinato de sódio | Carl Roth | 3195.1 | |
| Solução de tripsina / EDTA a 0,05% | Merck | L2153 | |
| 4-well- Lâminas de câmara de fundo de vidro | IBIDI | 80827 | revestidas com solução de gelatina a 0,1% |
| Amaxa Nucleofector II | O programa Lonza G-009 foi usado para eletroporação | ||
| LSM 780 ELYRA PS.1 sistema | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinina anticorpo | Abcam | ab9465 | diluição 1:200 |
| Connexin43 anticorpo | Santa Cruz | sc-9059 | diluição 1:200 |
| cabra anti-camundongo Alexa 594 anticorpo | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | diluição 1:300 |
| anticorpo anti-coelho de cabra Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | diluição 1:300 |
| Conexina43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | concentração final 250 nM |
| Near-IR Kit de coloração de células vivas/mortas | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI coloração nuclear | Thermo Scientific | D1306 |
Referências
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
