गैप जंक्शन-आश्रित का विश्लेषण 3 डी-फ्रेप माइक्रोस्कोपी के साथ miRNA का स्थानांतरण
Summary
यहां, हम मेरियन आरएनए के अंतराल जंक्शन-आधारित शटलिंग के विश्लेषण के लिए फोटोबलीचिंग (3 डी-एफआरएपी) के बाद त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति वसूली के आवेदन का वर्णन करते हैं। आमतौर पर लागू किए जाने वाले तरीकों के विपरीत, 3D-FRAP, वास्तविक समय में छोटे आरएनए के अंतरण हस्तांतरण की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, जिसमें उच्च स्थान-अस्थायी संकल्प शामिल हैं।
Abstract
सेलुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी में एक छोटी सी एंटीसेन्स आरएनए, जैसे एमआईआरएनए और सीआरएनए, एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसके अलावा, कई रोगों के उपचार में चिकित्सीय एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। MiRNA / siRNA चिकित्सा के लिए नई, अभिनव रणनीतियों का विकास अंतर्निहित तंत्रों के व्यापक ज्ञान पर आधारित है। हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि छोटे आरएनए एक अंतर जंक्शन-निर्भर तरीके से कोशिकाओं के बीच आदान-प्रदान किया जाता है, जिससे प्राप्तकर्ता सेल में जीन नियामक प्रभाव उत्पन्न होता है। आणविक जैविक तकनीकों और प्रवाह साइटेमेट्रिक विश्लेषण आमतौर पर miRNA के अंतःविषय विनिमय का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों से उच्च अस्थायी संकल्प नहीं मिलता है, जो आवश्यक है जब अणुओं के अंतराल जंक्शन प्रवाह का अध्ययन करते हैं। इसलिए, miRNA / siRNA के प्रभाव को जांचने के लिए कोशिकीय संकेतन अणुओं के रूप में, उपन्यास उपकरण आवश्यक हैं जो सेलुलर स्तर पर इन छोटे आरएनए के विश्लेषण के लिए अनुमति देगा। वर्तमान प्रोटोकॉल एपी का वर्णन करता हैहृदय कोशिकाओं के बीच miRNA अणुओं के अंतराल जंक्शन-आश्रित विनिमय को स्पष्ट करने के लिए फोटोबलीचिंग (3 डी-एफआरएपी) माइक्रोस्कोपी के बाद तीन-आयामी प्रतिदीप्ति वसूली का संकल्प महत्वपूर्ण बात यह है कि इस सीधी और गैर-इनवेसिव लाइव-सेल इमेजिंग दृष्टिकोण वास्तविक समय में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले छोटे आरएनए के अंतराल को जोड़ते हुए दृश्यमान और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, उच्च स्थान-अस्थायी संकल्प के साथ। 3D-FRAP द्वारा प्राप्त आंकड़ों में अंतरण जीन विनियमन के एक नये मार्ग की पुष्टि होती है, जहां छोटे आरएनए कोशिकीय नेटवर्क के भीतर संकेत अणुओं के रूप में कार्य करते हैं।
Introduction
सेलुलर जीन विनियमन में छोटे गैर-कोडिंग आरएनए महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। ये अणु 20-25 न्युक्लिओटिड्स से बना होते हैं जो एक विशिष्ट लक्ष्य एमआरएनए से जुड़े होते हैं, जिससे अनुवाद की रुकावट या एमआरएनए विघटन 1 , 2 हो । छोटे आरएनए, जैसे कि miRNA और सीआरएनए द्वारा जीन विनियामक प्रक्रिया, एक बहुत ही संरक्षित तंत्र है जो कई अलग-अलग प्रजातियों में पाया गया है 3 विशेष रूप से, प्रसार, भेदभाव और पुनर्जन्म 4 , 5 सहित विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए miRNA अणु महत्वपूर्ण महत्व के हैं। इसके अलावा, miRNA अभिव्यक्ति के dysregulation कई रोग विकारों के लिए जिम्मेदार है। इसी प्रकार, miRNA को रोग निदान के लिए बायोमार्कर के रूप में और जीन थेरेपी 6 , 7 के लिए चिकित्सीय एजेंट के रूप में उपयुक्त माना गया है </sup>।
गैप जंक्शन (जीजे) दो आसन्न कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में विशेष प्रोटीन संरचनाएं हैं जो 1 केडी तक के आणविक भार वाले अणुओं के विलय का आदान-प्रदान करते हैं। वे ऊतक के विकास, भेदभाव, सेल की मृत्यु और कैंसर या हृदय रोग 8 , 9 , 10 जैसे रोग विकारों के लिए महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। कई अणुओं को जीजे चैनलों को पार करने में सक्षम होने के रूप में वर्णित किया गया है, जिसमें आयन, चयापचयों, और न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि, जीजे भी छोटे आरएनए 11 , 12 के द्विपक्षीय आंदोलन के लिए एक मार्ग प्रदान करने के लिए मिले थे। इस प्रकार, miRNA केवल उस कक्ष के भीतर ही कार्य कर सकते हैं जिसमें वे उत्पन्न होते हैं, लेकिन प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के भीतर भी। यह इंटरसेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन सिस्टम में miRNA की भूमिका को रेखांकित करता है। उसी समय, डेटा का प्रदर्शन होता हैउस अंतराल के जंक्शन जंक्शन से संप्रेषक संचार को मीरएनए समारोह से निकट से जुड़ा हुआ है। टिशू होमोस्टेसिस, पैथोलॉजी, और निदान पर miRNA और जीजे के महत्वपूर्ण प्रभाव की वजह से, जीजे के कार्य की व्यापक समझ और miRNA की संबंधित गतिवर्ती गति को miRNA- आधारित रोगों के तंत्रों को स्पष्ट करने और नई रणनीति विकसित करने में मदद मिलेगी MiRNA चिकित्सा
अंतराल जंक्शन जंक्शन के आधार पर, कोशिकाओं के बीच miRNA अणुओं का स्थानांतरण एक बहुत तेजी से प्रक्रिया हो सकता है। इसलिए, एक पद्धति जो इन नियामक संकेतों के अणुओं के त्वरित मध्यवर्ती आंदोलन के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देती है। आम तौर पर, छोटे आरएनए 11 , 12 , 13 , 14 की शटलिंग को प्रदर्शित करने के लिए प्रवाह कोशिकामितीय और आणविक जैविक तकनीकों को लागू किया गया है। हालांकि, FRAP माइक्रोज़ के विपरीतप्रतिलिपि, इन तरीकों के उच्च अस्थायी संकल्प की कमी है, जो जीजे के माध्यम से miRNA के आदान-प्रदान का विश्लेषण करते समय अनिवार्य है। इसके अलावा, FRAP माइक्रोस्कोपी कम आक्रामक है और इसलिए कई सेल प्रकार 15 , 16 , 17 में अणुओं के जीजे-आश्रित विनिमय का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली और उपन्यास लाइव-सेल इमेजिंग तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है।
यहां, हम कार्डियोयोमोसाइट्स के बीच miRNA शटलिंग का मूल्यांकन करने के लिए 3D-FRAP के आवेदन का विस्तृत वर्णन करते हुए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रयोजन के लिए, कार्डियोयोमोसाइट्स fluorescently लेबल miRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे इस miRNA के साथ चिह्नित एक सेल को फोटोब्लिच किया गया था, और आसन्न कोशिकाओं से अंतर जंक्शन रिहायर्न्जियल miRNA एक समय-निर्भर तरीके से दर्ज किया गया था। एफआरएपी प्रयोगों के उच्च अस्थायी संकल्प से जीवित कोशिकाओं के बीच miRNA और siRNA के अंतरण हस्तांतरण के सटीक मूल्यांकन के लिए गतिज अध्ययन करने की संभावना प्रदान की जाती है। Moreoदेखें, चूंकि छोटे आरएनए को अलग-अलग कैनेटीक्स के साथ अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से विमर्श किया जा सकता है, FRAP माइक्रोस्कोपी इस बात को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है कि जीजे किस प्रकार संबंधित शटलिंग प्रक्रियाओं में शामिल हैं 18 । इसके अलावा, जीजे पारगम्यता में शारीरिक और रोग परिवर्तनों की जांच के लिए 3 डी-एफआरएपी का इस्तेमाल किया जा सकता है और छोटे आरएनए ट्रांसफर 15 , 1 9 पर इसका असर।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेलियन फिजियोलॉजी में एमआईआरएनए प्रमुख खिलाडी हैं और इनके बीच- दूसरे शब्दों में – जीजेएस इंटरसेल्यूलर एक्सचेंज 11 , 12 , 22 के लिए एक मार्ग के रूप में उपयोग करके संकेत अ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम शिक्षा और अनुसंधान संघीय संघ (FKZ 0312138 ए और एफकेजेड 31615 9) के संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित था, यूरोपीय संघ के स्ट्रक्चरल फंड्स (ईएसएफ / IVWM-B34-0030 / 10 और ईएसएफ़ / आईवीबीएम-बी 35-0010 / एमएपी) के साथ राज्य मैक्लेनबर्ग-पश्चिमी पोमेरानिया 12), डीएफजी (डीए 12 9 6), और जर्मन हार्ट फाउंडेशन (एफ / 01/12)। इसके अतिरिक्त, आरडी को रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (88 9 001), डीएएमपी फाउंडेशन और बीएमबीएफ (वीआईपी + 00240) के फोर्न प्रोग्राम द्वारा समर्थित है।
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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