Analys av Gap Junction-beroende överföring av miRNA med 3D-FRAP-mikroskopi
Summary
Här beskriver vi tillämpningen av tredimensionell fluorescensåterhämtning efter photobleaching (3D-FRAP) för analys av gapförbindelsebärande shuttling av miRNA. I motsats till vanliga tillämpade metoder möjliggör 3D-FRAP kvantifiering av den intercellulära överföringen av små RNA i realtid, med hög spatio-temporal upplösning.
Abstract
Små antisense-RNA, som miRNA och siRNA, spelar en viktig roll i cellfysiologi och patologi och kan dessutom användas som terapeutiska medel vid behandling av flera sjukdomar. Utvecklingen av nya, innovativa strategier för miRNA / siRNA-terapi bygger på en omfattande kunskap om de underliggande mekanismerna. Nyliga data antyder att små RNA utbyts mellan celler på ett klyftkopplingsberoende sätt, vilket därigenom inducerar genregleringseffekter i mottagarcellen. Molekylära biologiska tekniker och flödescytometrisk analys används vanligtvis för att studera intercellulär utbyte av miRNA. Dessa metoder ger emellertid inte hög tidsmässig upplösning, vilket är nödvändigt när man studerar gapförloppsflödet av molekyler. För att undersöka effekten av miRNA / siRNA som intercellulära signalmolekyler behövs därför nya verktyg som möjliggör analys av dessa små RNA på cellulär nivå. Det föreliggande protokollet beskriver apPlication av tredimensionell fluorescensåtervinning efter photobleaching (3D-FRAP) -mikroskopi för att belysa klyftanslutningsberoende utbyte av miRNA-molekyler mellan hjärtceller. Viktigt är att detta enkla och icke-invasiva levande cellbildnings-tillvägagångssätt möjliggör visualisering och kvantifiering av gapförbindelseshanteringen av fluorescensmärkta små RNA i realtid med hög spatio-temporal upplösning. De data som erhållits genom 3D-FRAP bekräftar en ny väg för intercellulär genreglering, där små RNA verkar som signalerande molekyler inom det intercellulära nätverket.
Introduction
Små icke-kodande RNA är viktiga aktörer inom cellulär genreglering. Dessa molekyler är sammansatta av 20-25 nukleotider som binder till ett specifikt målmRNA, vilket leder till blockering av translation eller till mRNA-nedbrytning 1 , 2 . Genregleringsprocessen som genomförs av små RNA, såsom miRNA och siRNA, är en mycket konserverad mekanism som har hittats i många olika arter 3 . I synnerhet är miRNA-molekyler av avgörande betydelse för en mängd olika fysiologiska processer, inklusive proliferation, differentiering och regenerering 4 , 5 . Dessutom tillskrivs dysreguleringen av miRNA-uttryck till många patologiska störningar. På motsvarande sätt har miRNAs visat sig vara lämpliga som biomarkörer för diagnos och som terapeutiska medel för genterapi 6 , 7 </sup>.
Gap junctions (GJ) är specialiserade proteinkonstruktioner i plasmamembranet i två intilliggande celler som tillåter diffusionsbyte av molekyler med en molekylvikt på upp till 1 kD. De har visat sig vara viktiga för vävnadsutveckling, differentiering, celldöd och patologiska störningar som cancer eller kardiovaskulär sjukdom 8 , 9 , 10 . Flera molekyler har beskrivits som förmåga att korsa GJ-kanaler, inklusive joner, metaboliter och nukleotider. Intressant visade sig även GJ att tillhandahålla en väg för den intercellulära rörelsen av små RNA 11 , 12 . Således kan miRNAs agera inte bara inom cellen där de produceras utan även inom mottagarceller. Detta belyser rollen av miRNA i det intercellulära signaltransduktionssystemet. Samtidigt visar dataDen mellanliggande intercellulära kommunikationsgapet är nära kopplat till miRNA-funktionen. På grund av den betydande inverkan av miRNA och GJ på vävnadshomeostas, patologi och diagnos, kommer en övergripande förståelse av GJs funktion och den relaterade intercellulära dynamiken hos miRNA att bidra till att klargöra mekanismerna för miRNA-baserade sjukdomar och att utveckla nya strategier för MiRNA-terapier.
Beroende på omfattningen av gapförbindelsekopplingen kan överföringen av miRNA-molekyler mellan celler vara en mycket snabb process. Därför krävs en metod som möjliggör visualisering och kvantifiering av den snabba intercellulära rörelsen hos dessa regulatoriska signalmolekyler. Vanligtvis har flödescytometri och molekylära biologiska tekniker applicerats för att demonstrera shuttling av små RNA 11 , 12 , 13 , 14 . Men i motsats till FRAP-mikroKopiera, dessa tillvägagångssätt saknar hög temporal upplösning, vilket är obligatoriskt när man analyserar utbytet av miRNA via GJs. Dessutom är FRAP-mikroskopi mindre invasiv och representerar därför en kraftfull och ny levande cellbildnings teknik för att utvärdera den GJ-beroende molekylutbytet i flera celltyper 15 , 16 , 17 .
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver tillämpningen av 3D-FRAP för att bedöma miRNA shuttling mellan kardiomyocyter. För detta ändamål transfekterades kardiomyocyter med fluorescensmärkta miRNA. En cell märkt med detta miRNA fotograferades och gap-förenings-miRNA-återinflödet från intilliggande celler registrerades på ett tidsberoende sätt. Den höga temporala upplösningen av FRAP-experiment erbjuder möjligheten att utföra kinetiska studier för den exakta utvärderingen av den intercellulära överföringen av miRNA och siRNA mellan levande celler. MoreoEftersom små RNA kan utbytas via olika mekanismer med mycket olika kinetik kan FRAP-mikroskopi bidra till att klargöra i vilken utsträckning GJ är involverade i respektive shuttlingprocesser 18 . Dessutom kan 3D-FRAP användas för att undersöka fysiologiska och patologiska förändringar i GJ-permeabiliteten och dess inverkan på liten RNA-överföring 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs är nyckelaktörer inom cellfysiologi och visade sig fungera som signalerande molekyler genom att använda-bland annat -GJs som en väg för intercellulär utbyte 11 , 12 , 22 . Det aktuella protokollet presenterar en in vitro- levande cellbildnings teknik för att karakterisera denna GJ-beroende shuttling med användning av fluorescerande miRNA i cellklyftor.
Protokollet utvec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Förbundsministeriet för utbildning och forskning Tyskland (FKZ 0312138A och FKZ 316159), staten Mecklenburg-Vorpommern med EU: s strukturfonder (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 och ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), och German Heart Foundation (F / 01/12). Dessutom stöds RD av FORUN-programmet för Rostock University Medical Center (889001), DAMP Foundation och BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
Referências
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
