מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.
Abstract
גרגר אסטרוציטומה נוירונים (CGNs) הם מודל עצביים נפוץ, ויוצרים אוכלוסיה הומוגנית שופע המוח הקטן. לאור שלהם אחרי לידה, שפע ופיתוח נגישות, CGNs הם מודל אידיאלי ללמוד תהליכים עצביים, כולל פיתוח עצביים, הגירה העצבית של גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית. בנוסף, תרבויות CGN לספק מודל מצוין ללימוד מצבים שונים של מוות של תאים כולל excitotoxicity ואפופטוזיס. בתוך שבוע בתרבות, CGNs מבטאים קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDA), קולטן ספציפי ionotropic גלוטמט עם פונקציות קריטיות רבות של מחלה ובריאות עצביים. התוספת של ריכוזים נמוכים של NMDA בשיתוף עם ממברנה דפולריזציה לתרבויות CGN ראשי מכרסם שימש לדגם גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית בעוד התוספת של ריכוזים גבוהים של NMDA יכול להיות מועסק לדגמן excitotoxic הפגיעה העצבית. . הנה, מתוארים שיטה של בידוד, culturing של CGNs בן יום 6 גורים, כמו גם מניפולציה גנטית של CGNs על ידי adenoviruses ו lentiviruses. אנו גם נוכח פרוטוקולים ממוטבת כיצד לעורר NMDA-induced excitotoxicity, נמוך-אשלגן-induced אפופטוזיס, סטרס חמצוני, נזק לדנ א בעקבות התמרה חושית של נוירונים אלה.
Introduction
גרגר אסטרוציטומה נוירונים (CGNs) מאופיינים היטב בתרבות, שמשו כמודל יעיל ללמוד מוות עצביים ו פיתוח 1,2,3,4,5, 6. הביטוי מוקדם של N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים CGN תרבויות במבחנה גורם להם מודל אטרקטיבי ללמוד NMDA-induced איתות. ההפעלה של רצפטורים אלו עם NMDA בשיתוף עם ממברנה דפולריזציה משמשת למדל גירוי פיזיולוגי פעילות. עצבית, אפשרה למחקר לתוך מנגנוני הפלסטיות הסינפטית 7,8. להפך, גירוי יתר של רצפטורים אלו על ידי ליגנד NMDA יכול לשמש לדגם excitotoxicity, מנגנון מרכזי של אובדן עצביים חריפה נזק מוחי, ניווניות מחלות 9. מנגנון אחד אינדוקציה של excitotoxicity היא דרך ATP רעב עם חמצן מופחתת, כפי ראו בפציעה חריפה עצביים. התוצאה היא ממברנה דפולריזציה, רמות גבוהות של גלוטמט לשחרר את הסינפסה. Overstimulation הבאים של קולטן NMDA על ידי תוצאות מוגברות גלוטמט מופרז Ca2 + זרם דרך רצפטורים אלו, אשר בתורו מפעיל כמה מסלולים כולל Ca2 +-להפעיל פרוטאזות, phospholipases, ו endonucleases, וכתוצאה מכך השפלה בלתי מבוקרת של רכיבים קריטיים הסלולר, מוות של תאים. בנוסף, גבוהה תאיים Ca2 + מוביל הדור של רדיקלים חופשיים של חמצן, נזק מיטוכונדריאלי 10,11.
בעוד הרוב המכריע של אובדן עצביים בעקבות NMDA-induced excitotoxicity עצביים בשל זרם סידן והוא באקס/באק עצמאית, מנגנונים אחרים של מוות של תאים לא ייכללו מודל זה. המראה של שניהם עם נמק, מוות כמו מוות של תאים עקב excitotoxicity נובע חלקית הדור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ו- DNA נזק שנגרם על ידי גבוהה תאיים Ca2 רמות 12. נזק לדנ א תוצאות במוות עצביים באמצעות מנגנונים אפופטוטיים להיפגע, להיות בקורלציה עם ההיכר של מוות של תאים אפופטוטיים להיפגע, כגון הופעת גושים כרומטין וגופים אפופטוטיים להיפגע. אינדוקציה של אפופטוזיס מתווך דרך השחרור של ציטוכרום c של המיטוכונדריה, הוכח להיות תלויים באקס/באק oligomerization 13. Oligomerization באקס/באק מקדם נקבובית היווצרות ממברנה מיטוכונדריאלי החיצוני, וכתוצאה מכך ציטוכרום c לשחרר את ההפעלה של הרגולטורים פרו-אפופטוטיים להיפגע כפי שניתן לראות עם פציעה קלה איסכמי 14.
דור של ROS היא נושא משמעותי במוח עקב אנדוגני רמות נמוכות של נוגדי חמצון, יחד עם הדרישה חמצן גדול עצביים מתפקדים 15. כאשר נחשף אירוע איסכמי, סינתאז תחמוצת החנקן הוא upregulated, בייצור ניטריק אוקסיד והגברת מינים חמצן תגובתי 14. ריכוז מוגבר של רדיקלים של חמצן יכול לגרום נזק לדנ א ולגרום בעקיפין אנרגיה הרעבה. רמות גבוהות של מעברי כפול גדילי הדנ א הם לתקן על ידי הפעלת poly ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP-1), חלבון כרומטין מכורך האיקריוטים אחראי ותזרז את ההעברה של ADP-ריבוז יחידות מ- NAD+, תהליך חלק בלתי נפרד ה-DNA תיקון 16. עם זאת, עם נזק מופרז עקב סטרס חמצוני, עלולים PARP-1 הפעלת אנרגיה רעב עקב הניקוז המוגבר ב- NAD+, מצע הדרושים לייצור ATP באמצעות זרחון חמצוני. בסופו של דבר, סטרס חמצוני יפעילו אפופטוזיס באופן תלותי באקס/באק שמוביל מיטוכונדריאלי ציטוכרום c שחרור, הוכח לגרום נערכו מיטוכונדריאלי CGNs 17.
בסופו של דבר, שינויים בריכוז של אשלגן כלורי (אשלגן) בתרבויות CGN ניתן ליצור מודל דפולריזציה/אשלגן נמוכה מתווכת אפופטוזיס 18,19,20. כאשר הם נחשפים לרמות נמוכות של K+, CGNs עוברים שינויים פיזיולוגיים ברורים, וכתוצאה מכך הנחות של נשימה מיטוכונדריאלי והן גליקוליזה, לייחס הסלולר ירד הביקוש 21, וכן הפחתת רמות של גרעיני גורם-κB (NFκB) אשר מסדיר פעילויות כולל דלקת, הסינאפסית 22. המודל הזה הוא עניין מיוחד לצורך המחקר של מוות תאי במהלך ההתפתחות העצבית. הסביבה K+ נמוך באופן הדוק יותר דומה בתנאים פיזיולוגיים, וגורם ההיכר של מוות של תאים במהלך ההתפתחות העצבית 23.
לסיכום, CGNs מספקות מודל ארוכת שנים לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מוות עצביים והתנוונות. להלן כללי התנהגות יאפשר בידוד, culturing של CGNs, ביטוי או דיכוי של שביל גנטי מסוים באמצעות וירוסים, אינדוקציה של המוות עצביים באמצעות מנגנונים שונים המייצגים הפגיעה העצבית והתנוונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים שיטה פשוטה culturing של נוירונים גרגר אסטרוציטומה העכבר הראשי (CGNs), הפסד ורווח של תפקוד לימודי, מידול מנגנונים שונים של מוות של תאים. מספר גורמים משפיעים על הפארמצבטית את התוצאות באמצעות הליך זה דורש ניטור קרוב. אלה כוללים את הטוהר של תרבות כולל חיסול של תאי גליה בתרבות, המפגש של ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה ומענקים המכון הקנדי של בריאות המחקר איי-איי
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
