وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس
Summary
ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.
Abstract
الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كنس) نموذج العصبية شيوعاً، تشكل نسبة سكان متجانسة وفيرة في المخيخ. وفي ضوء التنمية اللاحقة للولادة، ووفرة، وإمكانية الوصول، كجنس نموذجا مثاليا دراسة العمليات العصبية، بما في ذلك تنمية الخلايا العصبية والهجرة العصبية، وتحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، تقدم الثقافات CGN نموذجا ممتازا لدراسة أوضاع مختلفة لموت الخلية بما في ذلك اكسسيتوتوكسيسيتي والمبرمج. في غضون أسبوع في الثقافة، أعرب كنس مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا)، مستقبل غلوتامات إيونوتروبيك محددة مع العديد من الوظائف الحيوية في الخلايا العصبية في الصحة والمرض. استخدمت إضافة تركيزات منخفضة من نمدا بالاقتران مع غشاء ديبولاريزيشن للقوارض الثقافات CGN الأولية لنموذج تحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية في حين يمكن أن تستخدم إضافة تركيزات عالية من نمدا لنموذج إصابة الخلايا العصبية اكسسيتوتوكسيك. هنا، يتم وصف طريقة العزل واستزراع لكنس من الجراء يوم 6 من العمر، فضلا عن التلاعب بالجينات لكنس غدية ولينتيفيروسيس. ونحن أيضا هذه البروتوكولات الأمثل في كيفية حفز المستحثة نمدا excitotoxicity والمبرمج التي يسببها البوتاسيوم منخفضة، والأكسدة وتلف الحمض النووي بعد توصيل هذه الخلايا العصبية.
Introduction
الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كنس) تتسم أيضا بالثقافة، وكانت بمثابة نموذج فعال لدراسة موت الخلايا العصبية والتنمية 1،2،3،،من45، 6-التعبير المبكر عن مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) في CGN الثقافات في المختبر يجعلها نموذجا جذاباً للدراسة التي يسببها نمدا الإشارات. تفعيل هذه المستقبلات مع نمدا بالاقتران مع depolarization غشاء يستخدم نموذج تحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية ل، وسمح للبحث في آليات اللدونة متشابك 7،8. على العكس من ذلك، يمكن استخدام التحفيز المفرط لهذه المستقبلات التي يجند نمدا لنموذج اكسسيتوتوكسيسيتي، إليه رئيسية لفقدان الخلايا العصبية في الأمراض تلف المخ والأعصاب الحاد 9. إليه واحدة لاستحثاث excitotoxicity عن طريق التجويع ATP مع انخفاض الأكسجين، كما رأينا مع إصابة الخلايا العصبية الحادة. هذه النتائج في غشاء ديبولاريزيشن والإفراج عن مستويات مرتفعة من الغلوتامات في المشبك. أوفيرستيموليشن اللاحقة من مستقبلات NMDA بنتائج غلوتامات مرتفعة في المفرط Ca2 + التدفق عبر هذه المستقبلات، الذي بدوره يقوم بتنشيط مسارات عدة بما في ذلك Ca2 +-تفعيل البروتياز، فوسفوليباسيس، و اندونوكليسيس، أدى إلى التدهور غير المنضبط من المكونات الخلوية الحرجة وموت الخلايا. عالية داخل الخلية Ca2 + بالإضافة إلى ذلك، يؤدي إلى توليد الجذور الحرة الأكسجين وتلف الميتوكوندريا 10،11.
بينما غالبية فقدان الخلايا العصبية بعد اكسسيتوتوكسيسيتي الخلايا العصبية التي يسببها نمدا هو بسبب تدفق الكالسيوم وهو باكس/باك مستقلة، لا يمكن استبعاد آليات أخرى لموت الخلايا من هذا الطراز. مظهر كل نخرية وأبوبتوتيك مثل موت الخلايا بسبب اكسسيتوتوكسيسيتي جزئيا نتيجة لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) والحمض النووي الضرر الناجم عن ارتفاع داخل الخلية Ca2 + مستويات 12. أضرار الحمض النووي يؤدي موت الخلايا العصبية من خلال آليات أبوبتوتيك، الذي يرتبط بالسمات المميزة لموت الخلية أبوبتوتيك، مثل مظهر الكروماتين الجماهير والهيئات أبوبتوتيك. التعريفي للمبرمج هو بوساطة من خلال إطلاق سراح ج الفسفرة من الميتوكوندريا، وقد ثبت أن يكون معتمداً على باكس/باك أوليجوميريزيشن 13. أوليجوميريزيشن باكس/باك يعزز تشكيل المسام في غشاء الميتوكوندريا الخارجي، مما أدى إلى الإفراج ج الفسفرة وتفعيل المنظمين برو-أبوبتوتيك كما رأينا مع الإصابات الدماغية معتدل 14.
جيل روس قضية هامة في الدماغ بسبب انخفاض مستويات المواد المضادة للأكسدة، مقترنة بشرط الأوكسجين كبيرة ل أداء الخلايا العصبية 15الذاتية. عندما تتعرض لحدث الدماغية، هو أكسيد النيتريك synthase upregulated، إنتاج أكسيد النيتريك وزيادة الأنواع الأكسجين التفاعلية 14. يمكن أن ينتج عنه تلف الحمض النووي زيادة تركيز الأكسجين الجذور ويسبب مجاعة الطاقة غير مباشر. مستويات عالية من الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل يتم علاجها بتفعيل بولي ADP-الريبوز بولمرس-1 (نشطت-1)، بروتين الكروماتين زمنياً حقيقية النواة مسؤولة عن تحفيز نقل وحدات شرطة أبوظبي-الريبوز من NAD+، جزءا لا يتجزأ من عملية إصلاح الحمض النووي 16. بيد مع مفرطة الضرر نتيجة للأكسدة، التنشيط نشطت-1 يمكن أن يسبب مجاعة الطاقة نتيجة لنزوح زيادة على ند+، ركيزة اللازمة لإنتاج ATP عن طريق الفسفرة. في نهاية المطاف، الأكسدة سوف يؤدي المبرمج بطريقة تعتمد باكس/باك مما يؤدي إلى الفسفرة المتقدرية ج الإفراج، ولقد ثبت للحث على تغيير طراز الميتوكوندريا في كنس 17.
أخيرا، يمكن استخدام تغييرات في تركيز كلوريد البوتاسيوم (بوكل) في الثقافات CGN طراز منخفضة البوتاسيوم/depolarization وساطة المبرمج 18،،من1920. عندما تتعرض لمستويات منخفضة من ك+، كنس الخضوع التغييرات الفسيولوجية متميزة، أسفر عن تخفيض التنفس المتقدرية وتحلل، يعزى إلى انخفاض الطلب الخلوية 21، فضلا عن انخفاض في مستويات النووية عاملاً-κB (NFκB) الذي ينظم الأنشطة بما في ذلك الالتهاب وانتقال متشابك 22. هذا النموذج أهمية خاصة لدراسة موت الخلية أثناء تطوير الخلايا العصبية. البيئة ك+ منخفضة أوثق تشبه الظروف الفسيولوجية، ويتسبب في السمات المميزة لموت الخلايا شهد خلال الخلايا العصبية التنمية 23.
وباختصار، كنس نموذجا منذ أمد بعيد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء موت الخلايا العصبية والانحطاط. سيسمح البروتوكول التالي العزلة واستزراع كنس أو التعبير أو القمع طريقا الوراثية خاصة باستخدام الفيروسات واستحثاث موت الخلايا العصبية عن طريق آليات مختلفة تمثل الإصابة العصبية والانحطاط.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم طريقة بسيطة لاستزراع الماوس الأساسي الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كجنس)، وفقدان والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة آليات مختلفة لموت الخلايا. هناك عدة عوامل تؤثر على إمكانية تكرار نتائج النتائج باستخدام هذا الإجراء الذي يتطلب رصداً دقيقا. وتشمل هذه نقاء الثقافة بما في ذلك القضا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا و “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” المنح لجعفر-ألف.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
