Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris
Summary
Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.
Abstract
Neurones cérébelleux granule (SCT) sont un modèle neuronal fréquemment utilisé, formant une abondante population homogène dans le cervelet. Compte tenu de leur développement après l’accouchement, l’abondance et l’accessibilité, SCT est un modèle idéal pour étudier les processus neuronaux, y compris le développement neuronal, la migration neuronale et la stimulation de l’activité neuronale physiologique. En outre, cultures CGN fournissent un excellent modèle pour l’étude des différents modes de mort cellulaire, y compris l’excitotoxicité et l’apoptose. Moins d’une semaine dans la culture, SCT exprime des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), un récepteur de glutamate ionotropiques spécifiques avec de nombreuses fonctions essentielles de santé neuronale et la maladie. L’ajout de faibles concentrations de NMDA en conjonction avec la dépolarisation de la membrane pour rongeurs cultures primaires de CGN a été utilisée pour modéliser la stimulation de l’activité neuronale physiologique tandis que l’ajout de concentrations élevées de NMDA peut être employée pour modéliser lésions neuronales excitotoxiques. Ici, une méthode d’isolement et de culture du SCT de chiots âgés de 6 jours ainsi que la manipulation génétique du SCT par adénovirus et lentivirus sont décrits. Nous avons également présents protocoles optimisés sur la façon de stimuler l’excitotoxicité induite par le NMDA, l’apoptose induite par la basse-potassium, stress oxydatif et lésions de l’ADN après transduction de ces neurones.
Introduction
Neurones cérébelleux granule (SCT) sont bien caractérisés en culture et ont servi comme un modèle efficace pour étudier la mort neuronale et développement 1,2,3,4,5, 6. l’expression précoce des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) en CGN cultures in vitro rend un modèle attrayant pour étudier NMDA induite par la signalisation. L’activation de ces récepteurs NMDA en conjonction avec la dépolarisation de la membrane est utilisée pour modéliser la stimulation de l’activité neuronale physiologiques et a permis pour la recherche sur les mécanismes de la plasticité synaptique 7,8. Au contraire, une stimulation excessive de ces récepteurs par ligand NMDA peut être utilisée pour modéliser l’excitotoxicité, des principaux mécanismes de la perte neuronale dans l’aigu des lésions cérébrales et neurodégénératives maladies 9. Un mécanisme pour l’induction de l’excitotoxicité est par famine ATP en oxygène réduite, comme on le voit avec les lésions neuronales aiguës. Cela se traduit par une dépolarisation membranaire et des concentrations élevées de glutamate de sortie au niveau de la synapse. La surstimulation subséquente du récepteur NMDA par élevés de glutamate provoque Ca2 + afflux excessif par l’intermédiaire de ces récepteurs, qui à son tour active plusieurs voies y compris Ca2 +-activation de protéases, phospholipases, et endonucléases, entraînant la dégradation incontrôlée des composantes cellulaires essentielles et mort cellulaire. En outre, haute intracellulaire Ca2 + conduit à la génération de radicaux libres d’oxygène et mitochondriale dommages 10,11.
Bien que la majorité de la perte neuronale suite excitotoxicité neuronale induite par le NMDA est due à l’influx de calcium et Bax/Bak indépendant, les autres mécanismes de mort cellulaire ne peuvent être exclus de ce modèle. L’apparition des deux nécrotiques et apoptose comme la mort cellulaire en raison de l’excitotoxicité est partiellement due à la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et des lésions de l’ADN provoquée par le haut intracellulaire Ca2 + niveaux 12. Dommages à l’ADN se traduit par la mort neuronale par le biais de mécanismes apoptotiques, étant en corrélation avec les caractéristiques de la mort cellulaire par apoptose, comme l’apparition de masses de chromatine et corps apoptotiques. Induction de l’apoptose est médiée par la libération du cytochrome c par la mitochondrie et s’est avérée être tributaire de Bax/Bak oligomérisation 13. Bax/Bak oligomérisation favorise la formation de pores dans la membrane mitochondriale externe, aboutissant à la libération du cytochrome c et l’activation de pro-apoptotic régulateurs comme on le voit avec une lésion ischémique doux 14.
Génération de ROS est un problème important dans le cerveau en raison du faible niveau endogène d’antioxydants, couplés avec l’exigence d’oxygène importante pour fonctionnement neuronal 15. Lorsqu’il est exposé à un événement ischémique, l’oxyde nitrique synthase est augmentée, production d’oxyde nitrique et d’espèces réactives de l’oxygène 14. L’augmentation de la concentration des radicaux d’oxygène peut entraîner des dommages à l’ADN et indirectement provoquer famine énergétique. Des niveaux élevés de cassures double brin de l’ADN sont corrigées par l’activation de poly ADP-ribose polymérase 1 (PARP-1), une protéine de la chromatine lié aux eucaryote responsable de catalyser le transfert d’unités d’ADP-ribose de NAD+, un processus faisant partie intégrante de Réparation de l’ADN 16. Cependant, avec des dommages excessifs à cause du stress oxydatif, activation de PARP-1 peut provoquer famine énergétique en raison de la vidange accrue sur NAD+, de substrat nécessaire à la production d’ATP par phosphorylation oxydative. En fin de compte, le stress oxydatif va déclencher l’apoptose d’une manière dépendante de Bax/Bak conduisant à la libération du cytochrome mitochondrique c et a été montré pour induire le remodelage mitochondriale dans SCT 17.
Enfin, les variations de concentration de chlorure de potassium (KCl) dans les cultures de la CGN peuvent être utilisées pour modéliser les bas potassium/dépolarisation médiée par apoptose 18,19,20. Lorsqu’ils sont exposés à de faibles concentrations de K+, SCT subissent des changements physiologiques distincts, ce qui entraîne des réductions de la respiration mitochondriale et la glycolyse, attribuée à la réduction de la demande cellulaire 21, ainsi que réduction des niveaux de facteur nucléaire-κB (NFκB) qui réglemente les activités, notamment l’inflammation et la transmission synaptique, 22. Ce modèle est particulièrement intéressant pour l’étude de la mort cellulaire au cours du développement neuronal. L’environnement K+ faible plus étroitement ressemble à des conditions physiologiques et provoque des signes de mort cellulaire vu au cours du développement neuronal 23.
En résumé, le SCT fournit un modèle depuis longtemps afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la mort neuronale et la dégénérescence. Le protocole suivant permettra d’isolement et culture du SCT, expression ou la répression d’une voie génétique particulière à l’aide de virus et l’induction de la mort neuronale par des mécanismes différents représentant la dégénérescence et les lésions neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous fournissons ici une méthode simple pour la mise en culture de neurones granule cervelet de souris primaire (SCT), de perte et de gain d’études de fonction et la modélisation des différents mécanismes de mort cellulaire. Plusieurs facteurs affectent la reproductibilité des résultats à l’aide de cette procédure qui nécessitent une surveillance étroite. Il s’agit de la pureté de la culture, y compris l’élimination des cellules gliales dans la culture, à la confluence de la culture et de maintenir …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches du Canada et les instituts de recherche en santé du Canada accorde à A.J..-a.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
