Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.
Abstract
Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) sind eine häufig verwendete neuronale Modell, bilden eine reiche homogene Bevölkerung im Kleinhirn. Im Hinblick auf ihre postnatale Entwicklung, Fülle und Zugänglichkeit sind CGNs ein ideales Modell, neuronale Prozesse, einschließlich der neuronalen Entwicklung, neuronale Migration und physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu studieren. Darüber hinaus bieten CGN Kulturen ein hervorragendes Modell für das Studium der verschiedenen Modi des Zelltods einschließlich Excitotoxizität und Apoptose. CGNs express innerhalb von einer Woche in Kultur N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren, eine spezifische Ionotropic Glutamat-Rezeptor mit vielen wichtigen Funktionen in neuronalen Gesundheit und Krankheit. Die Zugabe von geringen Konzentrationen von NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation, Nagetier CGN Primärkulturen wurde verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren, während die Zugabe von hohen Konzentrationen von NMDA eingesetzt werden kann, um zu modellieren Excitotoxic neuronalen Verletzungen. Hier werden eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von CGNs aus 6 Tage alten Welpen sowie genetische Manipulation von CGNs durch Adenoviren und Lentiviren beschrieben. Wir auch anwesend optimierte Protokolle wie NMDA-induzierte Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Apoptose, oxidativer Stress und DNA-Schäden nach Transduktion dieser Neuronen stimulieren.
Introduction
Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) zeichnen sich auch in der Kultur und dienten als ein effektives Modell neuronalen Tod und Entwicklung 1,2,3,4,5, zu studieren 6. der frühen Ausdruck der N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren in CGN Kulturen in Vitro macht ihnen ein attraktives Modell, NMDA-induzierte Signalisierung zu studieren. Aktivierung dieser Rezeptoren mit NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation wird verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren und hat für die Forschung über die Mechanismen der synaptischen Plastizität 7,8erlaubt. Im Gegenteil, kann über-Stimulation dieser Rezeptoren durch NMDA-Liganden Excitotoxizität, einen wichtigen Mechanismus der neuronaler Verlust in akuten Hirnschäden und Neurodegenerative Krankheiten 9modellieren verwendet werden. Ein Mechanismus für die Induktion der Excitotoxizität ist durch ATP Hunger mit reduzierter Sauerstoff mit akuten neuronalen Verletzung gesehen. Dies führt zu Membran-Depolarisation und erhöhte Konzentrationen von Glutamat frei an der Synapse. Die nachfolgenden Reizüberflutung des NMDA-Rezeptors durch erhöhte Glutamat führt zu übermäßiger Ca2 + Zustrom über diese Rezeptoren, die wiederum mehrere Wege einschließlich Ca2 +aktiviert-aktiviert Proteasen, Phospholipases, und jedoch, was in den unkontrollierten Abbau von kritischen zellulären Komponenten und Zelltod. Darüber hinaus führt hohe intrazelluläre Ca2 + auf die Generation der freie Sauerstoff-Radikale und mitochondriale Schäden 10,11.
Während die Mehrheit der neuronalen Verlust nach NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität aufgrund Kalzium Zustrom und Bax/Bak unabhängige, werden nicht andere Mechanismen des Zelltods von diesem Modell ausgeschlossen. Das Aussehen der beiden nekrotische und apoptotischen Zelltod durch Excitotoxizität teilweise durch die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und DNA-Schäden durchhohe intrazelluläre Ca 2 + Level 12ist. DNA-Schädigung führt zu neuronalen Tod durch Apoptose Mechanismen, mit Markenzeichen des apoptotischen Zelltod, wie das Auftreten von Chromatin Massen und Apoptotic Körper korreliert werden. Induktion der Apoptose ist vermittelt durch die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien und hat gezeigt, dass Bax/Bak Oligomerisierung 13abhängig sein. Bax/Bak Oligomerisierung fördert Porenbildung in der äußeren mitochondrialen Membran, was zu Cytochrom C Version und die Aktivierung der Pro-apoptotische Regulierungsbehörden wie mit milden ischämische Schädigung 14gesehen.
Generation von ROS ist ein wichtiges Thema im Gehirn aufgrund der niedrigen endogenen Antioxidantien, gepaart mit der großen Sauerstoffbedarf für neuronale funktionierenden 15. Wenn zu einem ischämischen Ereignis ausgesetzt, ist Stickoxid-Synthase hochreguliert, Produktion von Stickstoffmonoxid und Erhöhung der reaktiven Sauerstoff-Spezies- 14. Die erhöhte Konzentration von Sauerstoff-Radikalen kann DNA-Schäden führen und indirekt Energie Hunger verursachen. Hohes Maß an DNA-Doppelstrang-Brüche werden durch die Aktivierung von Poly ADP-Ribose-Polymerase-1 (PARP-1), eine eukaryotische Chromatin-gebundenen Protein verantwortlich für katalysieren die Übertragung der ADP-Ribose Einheiten von NAD+, ein integraler Bestandteil der Prozess behoben. DNA-Reparatur- 16. Jedoch mit unverhältnismäßig großer Schäden durch oxidativen Stress, kann Aktivierung von PARP-1 Energie Hungertod aufgrund der erhöhten Abfluss auf NAD+, notwendige Substrat für die ATP-Produktion durch Oxidative Phosphorylierung führen. Letztlich oxidativer Stress löst Apoptose in gewissem Bax/Bak abhängig zur mitochondrialen Cytochrom C Veröffentlichung, und hat gezeigt, dass mitochondriale Umbau in CGNs 17zu induzieren.
Zu guter Letzt können Konzentrationsänderungen von Kaliumchlorid (KCl) in CGN Kulturen zu niedrigen Kalium/Depolarisation vermittelte Apoptose 18,19,20Modell verwendet werden. Wenn auf ein niedriges Niveau von K+ausgesetzt, unterziehen CGNs unterschiedliche physiologische Veränderungen, was zu Kürzungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse, verminderte zelluläre Nachfrage 21, zugeschrieben sowie Abstriche an nuklearer Faktor-κB (NFκB) die Aktivitäten wie Entzündungen und synaptische Übertragung 22regelt. Dieses Modell ist von besonderem Interesse für das Studium der Zelltod während der neuronalen Entwicklung. Die niedrigen K+ Umwelt mehr ähnelt physiologische Bedingungen, und bewirkt, dass Kennzeichen des Zelltods gesehen während der neuronalen Entwicklung 23.
Zusammenfassend bieten CGNs eine langjährige Modell, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der neuronalen Tod und Degeneration zu untersuchen. Das folgende Protokoll ermöglicht Isolierung und Kultivierung von CGNs, Ausdruck oder Unterdrückung von bestimmten genetischen Weg mit Viren und die Induktion der neuronalen Tod durch unterschiedliche Mechanismen aus neuronalen Verletzungen und Degeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieten wir eine einfache Methode für die Kultivierung der primäre Maustaste zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs), Verlust und Gewinn von Funktionsstudien und Modellierung verschiedene Mechanismen des Zelltods. Mehrere Faktoren beeinflussen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit diesem Verfahren die engmaschige Überwachung erfordern. Dazu gehören die Reinheit der Kultur einschließlich der Beseitigung von Gliazellen in der Kultur, dem Zusammenfluss von der Kultur und Erhaltung gesunde Zellen. Einführung Vari…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit stützt sich auf Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada und der Canadian Institutes of Health Research räumt a.j.-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
