신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링
Summary
이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여
Abstract
소 뇌과 립 신경 (CGNs)는 소 뇌에 풍부한 균질 인구를 형성 일반적으로 사용 되 신경 모델입니다. 그들의 출생 개발, 풍부, 및 접근에 비추어 CGNs는 신경 프로세스, 신경 개발, 생리 적 신경 활동 자극, 신경 마이그레이션 등을 공부 하는 이상적인 모델입니다. 또한, CGN 문화 excitotoxicity 등 apoptosis는 세포 죽음의 다른 모드를 공부에 대 한 훌륭한 모델을 제공 합니다. 문화에 주, CGNs N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체, 신경 건강 및 질병에 많은 중요 한 기능을 가진 특정 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체를 표현 한다. 함께 설치류 기본 CGN 문화에 막 도발은 NMDA의 낮은 농도의 추가 동안 NMDA의 높은 농도의 추가 모델을 채택 될 수 있다 생리 적 신경 활동 자극을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. excitotoxic 신경 부상입니다. 여기, 격리의 방법 및 6 주 오래 된 강아지 adenoviruses와 lentiviruses CGNs의 유전자 조작에서 CGNs의 배양 설명 되어 있습니다. 우리는 또한 NMDA 유도 excitotoxicity, 낮은 칼륨-유도 된 apoptosis, 산화 스트레스와 DNA 손상 이러한 뉴런의 변환에 따라 자극 하는 방법에 현재 최적화 된 프로토콜.
Introduction
소 뇌과 립 신경 (CGNs) 문화에서 잘 성격을 나타낸다 고 신경 죽음 및 개발 1,2,3,,45, 연구는 효과적인 모델 역임 6. CGN 문화에서 체 외에 있는 N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체의 초기 식 게 NMDA 유도 신호를 공부 하는 매력적인 모델. 함께 막 도발은 NMDA와 함께 이러한 수용 체의 활성화 생리 적 신경 활동 자극, 모델링 하는 데 사용 되 고 시 냅 스가 소성 7,8의 메커니즘으로 연구에 대 한 허용 했다. 그와 반대로, NMDA ligand에 의해 이러한 수용 체의 과잉 자극 excitotoxicity, 급성 뇌 손상 및 신경 퇴행 성 질환 9신경 손실의 주요 메커니즘을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 신경 상해 본 excitotoxicity의 유도 대 한 메커니즘 중 하나 감소 산소와 ATP 기아 통해 이다. 그러면 막 도발은 고 조미료의 높은 수준의 시 냅 스에서 출시. 과도 한 Ca2 + 유입이 수용이 체를 통해 여러 경로 포함 하 여 캘리포니아2 +차례 차례로 활성화에 높은 조미료 결과 NMDA 수용 체의 후속 overstimulation-phospholipases, 프로 테아 제 활성화 및 endonucleases, 중요 한 세포 구성 요소와 세포 죽음의 통제 저하 발생 또한, 높은 세포내 캘리포니아2 + 리드 생성 산소 자유 래 디 칼 및 미토 콘 드리 아 손상 10,11.
NMDA 유발 신경 excitotoxicity 다음 신경 손실의 대부분은 칼슘 유입 때문 이며 Bax/박 독립,이 모델에서 세포 죽음의 다른 메커니즘을 제외할 수 없습니다. 회 저 성 둘 다의 외관 그리고 apoptotic 세포 죽음 excitotoxicity 때문 반응성 산소 종 (선생님)와 높은 세포내 캘리포니아2 + 레벨 12로 인 한 DNA 손상의 발생으로 인해 부분적으로 같은. DNA 손상 신경 죽음 apoptotic 세포 죽음, chromatin 대중과 apoptotic 시체의 모습 등의 연관 되는 apoptotic 메커니즘을 통해 결과. Apoptosis의 감 응 작용은 미토 콘 드리 아에서 시 토 크롬 c의 출시를 통해 중재 그리고 Bax/박 oligomerization 13에 종속 되도록 표시 되었습니다. Bax/박 oligomerization 시 토 크롬 c 출시 및 프로 apoptotic 레 귤 레이 터로 가벼운 허 혈 성 부상 14본의 활성화의 결과로 외부 미토 콘 드리 아 막의 기 공 형성을 촉진 합니다.
선생님의 세대 신경 기능 15큰 산소 요구와 결합 하는 항 산화 물질의 낮은 생 수준 때문에 뇌에서 중요 한 문제입니다. 허 혈 성 이벤트에 노출 되 면 산화 질소 synthase upregulated, 질소 산화물을 생성 하 고 반응성 산소 종 14증가입니다. 산소 래 디 칼의 농도 증가 DNA 손상 하 고 간접적으로 에너지 부족을 일으킬 수 있습니다. 높은 수준의 DNA 이중 가닥 나누기의 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-1 (PARP-1), 진 핵 chromatin-바인딩 단백질 catalyzing 나드+, 통합 하는 과정에서에서 ADP ribose 단위 전송에 대 한 책임의 활성화에 의해 조치를 취했고합니다 DNA 수리 16. 그러나, 산화 스트레스로 인해 과도 한 손상, PARP 1 활성화 하면 증가 드레인으로 인해 에너지 기아 나드+, 산화 인 산화를 통해 ATP 생산을 위한 필요한 기판에. 궁극적으로, 산화 스트레스는 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 출시로 이어지는 Bax/박 종속 방식으로 apoptosis를 일으킬 것 이다 그리고 유도 미토 콘 드 리아 CGNs 17개장을 보여줘 왔다.
마지막으로, 염화 칼륨 (KCl) CGN 문화에서의 농도에 변화 낮은 칼륨/도발은 중재 apoptosis 18,,1920를 사용할 수 있습니다. K+의 낮은 수준에 드러낼 때, CGNs 받아야 뚜렷한 생리 적 변화, 미토 콘 드리 아 호흡의 분해, 세포질 수요 감소 21에 감소 레벨의 감소에 있는 결과 핵 요인-κB (NFκB) 염증, 시 냅 스 전송 22등의 활동을 조절. 이 모형은 신경 발달 동안에 세포 죽음의 연구에 대 한 특정 관심의 이다. 낮은 K+ 환경 더 밀접 하 게 유사한 생리 적 조건, 고 신경 개발 23중 세포 죽음의.
요약 하자면, CGNs 신경 죽음 및 변성의 기본 분자 메커니즘을 조사 하는 오랜 모델을 제공 합니다. 다음 프로토콜 고립과 CGNs, 식 또는 바이러스 및 신경 상해 및 변성을 대표 하는 다른 메커니즘을 통해 신경 죽음의 유도 사용 하 여 특정 유전 통로의 억압의 경작을 허용할 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리는 기본 마우스 소 뇌과 립 신경 (CGNs), 손실 및 기능 연구의 이득의 경작 그리고 세포 죽음의 다른 메커니즘을 모델링에 대 한 간단한 방법을 제공 합니다. 여러 가지 요인을 가까운 모니터링을 요구 하는이 절차를 사용 하 여 결과의 재현성을 영향을 줍니다. 문화 문화, 문화의 합류에에서 glial 세포의 제거를 포함 하 고 건강 한 세포를 유지의 순도 포함 됩니다. 이러한 요인에 변화를 도?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다 지원 및 건강 연구의 캐나다 학회가 A로 부여
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
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