Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller
Summary
Denne protokollen beskriver en enkel metode for å isolere og dyrking hovedknappen på musen cerebral granule neurons (CGNs) fra 6-7 dag gammel pups, effektiv Albin på CGNs for tap og gevinst på funksjon studier, og modellering NMDA-indusert neuronal excitotoxicity, lav-kalium-indusert celledød, DNA-skader og oksidativt stress ved hjelp av samme kultur-modellen.
Abstract
Lillehjernen granule neurons (CGNs) er en vanlig neuronal modell, danner en rikelig homogen befolkning i lillehjernen. I lys av deres postnatal utvikling, overflod og tilgjengelighet er CGNs en ideell modell å studere neuronal prosesser, inkludert neuronal utvikling, neuronal migrasjon og fysiologiske neuronal aktivitet stimulering. I tillegg gir CGN kulturer en utmerket modell for å studere forskjellige moduser inkluderer excitotoxicity og apoptose-programmert celledød. Innen en uke i kultur uttrykke CGNs N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptorer, en bestemt ionotropic glutamat reseptor med mange viktige funksjoner i nevrale helse og sykdom. Tillegg av lave konsentrasjoner av NMDA sammen med membran depolarization gnager primære CGN kulturer har blitt brukt til å modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulering mens tillegg av NMDA kan brukes til å modellere excitotoxic neuronal skade. Her, er en metode for isolasjon og dyrking av CGNs fra 6 dagers gammel pups samt genetisk manipulering av CGNs av adenoviruses og lentiviruses beskrevet. Vi også tilstede optimalisert protokoller på hvordan å stimulere NMDA-indusert excitotoxicity, lav-kalium-indusert apoptose, oksidativt stress og DNA skade etter signaltransduksjon disse neurons.
Introduction
Lillehjernen granule neurons (CGNs) blir godt preget på kultur og har fungert som en effektiv modell neuronal død og utvikling 1,2,3,4,5, 6. tidlig uttrykk for N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptorer i CGN kulturer i vitro gjør dem en attraktiv modell å studere NMDA-indusert signalisere. Aktivering av disse reseptorene med NMDA sammen med membran depolarization brukes til å modellere fysiologiske neuronal aktivitet stimulering, og har tillatt for forskning i mekanismer for synaptiske plastisitet 7,8. Tvert imot, kan over stimulering av disse reseptorene av NMDA ligand brukes til å modellere excitotoxicity, en viktig mekanisme for neuronal tap i akutt hjerneskade og nevrodegenerative sykdommer 9. En mekanisme for induksjon av excitotoxicity er gjennom ATP sult med redusert oksygen, sett med akutt neuronal skade. Dette resulterer i membran depolarization og forhøyede nivåer av glutamat slipp på synapse. Den påfølgende overstimulering av NMDA reseptor av opphøyet glutamat resultater i overdreven Ca2 + tilstrømningen via disse reseptorene, som igjen aktiverer flere veier inkludert Ca2 +-aktivert proteaser, phospholipases, og endonucleases, som resulterer i ukontrollert nedbrytning av kritiske cellulære komponenter og celledød. I tillegg fører høy intracellulær Ca2 + til generering av oksygen frie radikaler og mitokondrie skade 10,11.
Mens flertallet av neuronal tap etter NMDA-indusert neuronal excitotoxicity av kalsium tilstrømningen og er Bax/Bak uavhengige, kan ikke andre mekanismer av celledød ekskluderes fra denne modellen. Utseendet på begge necrotic og apoptotisk som celledød på grunn av excitotoxicity er delvis på grunn av generasjonen av reaktive oksygen arter (ROS) og DNA skade forårsaket avhøye intracellulær Ca 2 + nivåer 12. DNA skade resulterer i neuronal døden gjennom apoptotisk mekanismer å være korrelert med kjennetegner apoptotisk celledød, som chromatin massene og apoptotisk organer. Induksjon av apoptose er formidlet gjennom utgivelsen av cytochrome c fra mitokondrier og har vist seg å være avhengig av Bax/Bak oligomerization 13. Bax/Bak oligomerization fremmer pore formasjon i den ytre mitokondrie membranen, som resulterer i cytochrome c utgivelsen og aktivering av pro-apoptotisk regulatorer sett med mild iskemiske skader 14.
Generasjon av ROS er et betydelig problem i hjernen som følge av lav endogene antioksidanter, kombinert med store oksygen kravet for neuronal fungerende 15. Når utsatt for iskemiske hendelse, er nitrogenoksid syntase upregulated, produsere nitrogenoksid og øke reaktive oksygen arter 14. Økt konsentrasjonen av oksygen radikaler kan resultere i DNA skader og indirekte føre energi sult. Høye nivåer av DNA double-strandet bryter er avhjulpet av aktivering av poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), en eukaryote chromatin-bundet protein ansvarlig for katalyserende overføring av ADP-ribose enheter fra NAD+, en prosess integrert DNA-reparasjon 16. Men med overdreven skade forårsaket av oksidativt stress, kan PARP-1 aktivisering forårsake energi sult på grunn av økt avløpet på NAD+, en nødvendig substrat for ATP produksjonen gjennom oxidative fosforylering. Til slutt, oksidativt stress vil utløse apoptose på en Bax/Bak avhengig måte fører til mitokondrie cytochrome c utgivelsen, og har vist seg å indusere mitokondrie ombygging i CGNs 17.
Endelig, endringer i konsentrasjon av kalium klorid (KCl) i CGN kulturer kan brukes til å modellere lavt kalium/depolarization mediert apoptose 18,19,20. Når de utsettes for lave nivåer av K+, gjennomgå CGNs distinkte fysiologisk endringer, som resulterer i reduksjon av både mitokondrie åndedrett og Glykolysen, tilskrevet redusert mobilnettet etterspørsel 21, samt reduksjon i nivåene av kjernefysiske faktor-κB (NFκB) som regulerer aktiviteter inkludert betennelse og synaptic overføring 22. Denne modellen er av spesiell interesse for studiet av celledød under neuronal utvikling. Lav K+ miljøet nærmere ligner fysiologiske forhold, og fører kjennetegner celledød under neuronal utvikling 23.
Oppsummert gir CGNs en langvarig modell for å undersøke de underliggende molekylære mekanismene neuronal død og degenerasjon. Følgende protokollen tillater isolasjon og dyrking av CGNs, uttrykk eller undertrykkelse av en bestemt genetiske veien med virus og induksjon av neuronal død via ulike mekanismer som representerer neuronal skade og degenerasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her gir vi en enkel metode for dyrking av hovedknappen på musen lillehjernen granule neurons (CGNs), tap og gevinst på funksjon studier og modellering forskjellige virkningsmekanismer celledød. Flere faktorer som påvirker reproduserbarhet resultatene ved hjelp av denne prosedyren som krever tett oppfølging. Disse inkluderer renheten av kulturen inkludert eliminering av gliacellene i kultur, der kulturen, og opprettholde friske celler. Innføre variasjon i disse faktorene kan påvirke resultatene og utfordre reprodus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada og Canadian institutter for helseforskning tilskudd til AJ-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
