Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов
Summary
Этот протокол описывает простой метод для изоляции и культивирования мыши мозгового гранул нейронов (КСГН) от 6-7 день старого щенков, эффективное трансдукции КСГН потери и получить функция исследований и моделирования NMDA-индуцированной Эксайтотоксичность нейронов, Низкий калий индуцированной клеточную гибель, повреждение ДНК и оксидативного стресса, с использованием той же модели культуры.
Abstract
Нейроны мозжечка гранул (КСГН) являются модель часто используемые нейронов, образуя обильные однородное население в мозжечке. В свете их послеродового развития, обилие и доступность КСГН являются идеальной моделью для изучения нейрональные процессы, включая развития нервной системы, нейронной миграции и стимуляция физиологической активности нейронов. Кроме того CGN культур обеспечивают отличную модель для изучения различных режимов гибели клеток, включая Эксайтотоксичность и апоптоз. В течение недели в культуре КСГН Экспресс N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторы, конкретные ИОНОТРОПНЫХ рецептор глутамата с много важных функций в нейрональных здоровья и болезни. Помимо низких концентраций NMDA в сочетании с деполяризации мембраны для грызунов первичной CGN культур был использован для моделирования стимуляция физиологической активности нейронов, в то время как добавление высоких концентраций NMDA могут быть использованы для моделирования excitotoxic нейронных травмы. Здесь описаны метод изоляции и культивирование КСГН от 6-дневных детенышей, а также генетические манипуляции КСГН, аденовирусы и lentiviruses. Мы также настоящий оптимизированный протоколы о том, как стимулировать NMDA-индуцированной Эксайтотоксичность, Низкий калий индуцированного апоптоза, окислительный стресс и повреждение ДНК, после передачи этих нейронов.
Introduction
Нейроны мозжечка гранул (КСГН) характеризуются также в культуре и служил в качестве эффективной модели для изучения нейрональных смерти и развития 1,2,3,4,5, 6. Раннее выражение N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторов в CGN культур в vitro делает их привлекательной модель для изучения NMDA-индуцированной сигнализации. Активация этих рецепторов с NMDA в сочетании с деполяризации мембраны используется для моделирования стимуляция физиологической активности нейронов и позволило для исследований в механизмы синаптической пластичности 7,8. Напротив, чрезмерная стимуляция этих рецепторов, NMDA лиганд может использоваться для моделирования Эксайтотоксичность, одним из основных механизмов нейронов потери острого повреждения головного мозга и нейродегенеративных заболеваний 9. Один механизм для индукции Эксайтотоксичность — через АТФ голода с сокращения кислородная, как видно с острой нейронных травмы. Это приводит к деполяризации мембраны и повышенные уровни глутамата отпустить в синапсе. Последующее перевозбуждения NMDA рецепторы повышенных глутамата результаты в чрезмерной Ca2 + приток через эти рецепторы, которые в свою очередь активирует несколько путей, включая Ca2 +-активированный протеаз, фосфолипаз, и эндонуклеазами, что приводит к неконтролируемым деградации важнейших клеточных компонентов и гибели клеток. Кроме того высокая внутриклеточных Ca2 + приводит к генерации свободных радикалов кислорода и митохондриальной повреждения 10,11.
Хотя большинство нейронов потери после NMDA-индуцированной нейрональных Эксайтотоксичность из-за притока кальция и Bax/бак независимой, другие механизмы клеточной смерти нельзя исключить из этой модели. Внешний вид как некротические и apoptotic как смерть клетки из-за Эксайтотоксичность частично объясняется поколения реактивнооксигенных видов (ров) и повреждения ДНК, вызванные высокой внутриклеточных Ca2 + уровнях 12. Повреждение ДНК приводит к гибели нейронов через механизмов апоптоза, коррелирует с отличительными чертами смерть клетки apoptotic, например появление хроматина масс и apoptotic тела. Индукции апоптоза опосредовано через выпуск c тситохрома из митохондрий и было показано, чтобы быть зависимым от Bax/бак олигомеризации 13. Bax/бак олигомеризации способствует порообразования в внешней митохондриальной мембраны, цитохром с выпуска и активация pro-apoptotic регуляторы как видно с мягким ишемического повреждения 14.
Поколение ROS является важным вопросом в головном мозге из-за низкого уровня эндогенных антиоксидантов, в сочетании с требованием большой кислорода для нейронов функционирования 15. При воздействии ишемических событий, синтаза оксида азота является upregulated, производство оксида азота и увеличивая реактивнооксигенных видов 14. Повышенная концентрация радикалов кислорода может привести к повреждению ДНК и косвенно вызвать нехватку энергии. Высокий уровень двуцепочечные разрывы ДНК были устранены путем активации поли АДФ рибоза полимеразы-1 (ПАРП-1), эукариотических хроматина прыгните белка, ответственных за стимулирование передачи АДФ рибоза единиц от NAD+, неотъемлемой частью процесса ДНК ремонт 16. Однако с чрезмерный ущерб вследствие оксидативного стресса, ППА-1 Активация может привести к энергии голода вследствие увеличения стока NAD+, необходимым субстратом для производства АТФ через окислительное фосфорилирование. В конечном счете Оксидативный стресс будет вызывать апоптоз в духе иждивенца Bax/бак, ведущих к митохондрий цитохрома с выпуска и было показано, чтобы побудить митохондриальной перепланировка в КСГН 17.
Наконец изменения концентрации хлорида калия (KCl) в CGN культур может использоваться для моделирования низкого калия/деполяризации опосредованной апоптоз 18,19,20. При низких уровней K+, КСГН подвергнуться различные физиологические изменения, в результате сокращения митохондриальное дыхание и гликолиз, приписываемых снижение спроса сотовых 21, а также снижение уровней ядерный фактор κB (NFκB) который регулирует деятельность, включая воспаление и синаптической передачи 22. Эта модель представляет особый интерес для изучения смерти клетки во время развития нервной системы. K+ окружающей среды низкой более тесно напоминает физиологических условиях и вызывает клейма смерти клетки во время развития нейронов 23.
В целом КСГН предоставляют модель давно расследовать глубинные механизмы нейрональных смерти и дегенерации. Следующий протокол позволит изоляции и культивирования КСГН, выражение или репрессии в отношении конкретного генетического пути, с использованием вирусов и индукции гибели нейронов через различные механизмы, представляющих нейронных травмы и дегенерации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем простой метод для культивирования мыши нейронов мозжечка гранул (КСГН), потери и выгоды функции исследований и моделирования различных механизмов клеточной смерти. Воспроизводимости результатов, с помощью этой процедуры, которые требуют тщательного мониторинг…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается естественных наук и инженерных исследований Совет Канады и канадской институтов здравоохранения исследовательских грантов с A.J.-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
