Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón
Summary
Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.
Abstract
Las neuronas cerebelosas del gránulo (CGNs) son un modelo neuronal comúnmente utilizado, formando una abundante población homogénea en el cerebelo. A la luz de su desarrollo post-natal, abundancia y accesibilidad, CGNs son un modelo ideal para el estudio de procesos neuronales, incluyendo el desarrollo neuronal, la migración neuronal y estimulación de la actividad neuronal fisiológico. Además, las culturas de la CGN proporcionan un excelente modelo para estudiar modos de muerte celular como excitotoxicidad y apoptosis. Dentro de una semana en cultura, CGNs expresan los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA), un receptor de glutamato ionotrópicos específicos con muchas funciones esenciales en salud neuronal y la enfermedad. La adición de bajas concentraciones de NMDA junto con despolarización de la membrana para roedores cultivos primarios de la CGN se ha utilizado para estimulación de la actividad neuronal fisiológica mientras que la adición de altas concentraciones de NMDA puede ser empleada para modelar lesión neuronal excitotóxicos. Aquí, se describen un método de aislamiento y cultivo de CGNs de cachorros 6 días de edad, así como la manipulación genética de CGNs por adenovirus y lentivirus. Tenemos también presente protocolos optimizados sobre cómo estimular la apoptosis inducida por potasio bajo, estrés oxidativo, excitotoxicidad inducida por NMDA y daño de la DNA después de la transducción de estas neuronas.
Introduction
Las neuronas cerebelosas del gránulo (CGNs) están bien caracterizadas en la cultura y han servido como un modelo eficaz para estudiar la muerte neuronal y desarrollo 1,2,3,4,5, 6. la temprana expresión de los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) en culturas CGN en vitro hace un atractivo modelo para estudiar la señalización inducida por el NMDA. Activación de estos receptores con NMDA junto con despolarización de la membrana se utiliza para modelar la estimulación fisiológica de la actividad neuronal y ha permitido para la investigación en los mecanismos de plasticidad sináptica 7,8. Por el contrario, exceso de estimulación de estos receptores por el ligando NMDA puede utilizarse para modelar la excitotoxicidad, un mecanismo importante de pérdida neuronal en aguda lesiones cerebrales y neurodegenerativas enfermedades 9. Un mecanismo para la inducción de la excitotoxicidad es a través de la inanición de ATP con oxígeno reducido, como se observa en lesión neuronal aguda. Esto se traduce en la despolarización de la membrana y liberan niveles elevados de glutamato en la sinapsis. La subsiguiente estimulación del receptor NMDA de glutamato elevados resultados en exceso Ca2 + afluencia a través de estos receptores, que a su vez activa varias vías incluyendo Ca2 +-activa proteasas, fosfolipasas, y Endonucleasas, dando por resultado la degradación incontrolada de críticos componentes celulares y muerte celular. Además, alta Ca intracelular2 + conduce a la generación de radicales libres de oxígeno y daño mitocondrial 10,11.
Mientras que la mayoría de la pérdida neuronal después de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA es debido a la afluencia del calcio y Bax/Bak independiente, no pueden excluirse otros mecanismos de muerte celular de este modelo. La aparición de ambos necrótico y apoptosis muerte celular por excitotoxicidad es parcialmente debido a la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y daño del ADN causado poralta intracelular Ca 2 + niveles 12. Daño de la DNA resulta en la muerte neuronal a través de mecanismos de apoptosis se correlacionan con señas de identidad de muerte celular por apoptosis, como la aparición de las masas de cromatina y cuerpos apoptóticos. Inducción de la apoptosis es mediada por la liberación de citocromo c desde la mitocondria y se ha demostrado para ser dependiente en la Oligomerización de Bax/Bak 13. Oligomerización de Bax/Bak promueve la formación de poros en la membrana mitocondrial externa, dando por resultado la liberación del citocromo c y la activación de pro-apoptótica reguladores con lesión isquémica leve 14.
Generación de ROS es un problema importante en el cerebro debido a los bajos niveles endógenos de antioxidantes, juntados con la necesidad de oxígeno grande para el funcionamiento neuronal 15. Cuando se expone a un evento isquémico, óxido nítrico sintasa es upregulated, produciendo óxido nítrico y aumento de especies reactivas de oxígeno 14. La mayor concentración de radicales de oxígeno puede causar daño en el ADN e indirectamente causar hambre de energía. Altos niveles de roturas de doble hebra de DNA son evacuados por la activación de la poli ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1), una proteína enlazado a la cromatina eucariota responsable de catalizar a la transferencia de unidades de ADP-ribosa del NAD+, un proceso integral que 16de reparación del ADN. Sin embargo, con excesivo daño por estrés oxidativo, activación de la PARP-1 puede causar hambre de energía debido al creciente drenaje de NAD+, un sustrato necesario para la producción de ATP mediante la fosforilación oxidativa. En última instancia, estrés oxidativo dispara la apoptosis en una manera de dependientes de Bax/Bak conduce a liberación c del citocromo mitocondrial y se ha demostrado para inducir el remodelado mitocondrial en CGNs 17.
Finalmente, cambios en la concentración de cloruro de potasio (KCl) en las culturas de la CGN pueden utilizarse para modelar bajo potasio/despolarización mediada por apoptosis 18,19,20. Cuando está expuesto a bajos niveles de K+, CGNs experimentan cambios fisiológicos distintos, dando por resultado la reducción de la respiración mitocondrial y la glicolisis, atribuido a disminución demanda celular 21, así como reducción en los niveles de nuclear factor-KB (NFκB) que regula las actividades incluyendo inflamación y transmisión sináptica 22. Este modelo es de particular interés para el estudio de la muerte celular durante el desarrollo neuronal. El ambiente K+ bajo más de cerca se asemeja a las condiciones fisiológicas y hace señas de identidad de muerte celular durante el desarrollo neuronal 23.
En Resumen, CGNs proporcionan un modelo de larga data para investigar los mecanismos moleculares subyacentes de degeneración y muerte neuronal. El siguiente protocolo permitirá aislamiento y cultivo de CGNs, expresión o represión de una particular vía genética con el virus y la inducción de la muerte neuronal por mecanismos diferentes que representan la degeneración y lesión neuronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí le ofrecemos un método simple para el cultivo de neuronas cerebelosas del gránulo de primario de ratón (CGNs), pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de diferentes mecanismos de muerte celular. Varios factores afectan la reproducibilidad de los resultados mediante este procedimiento que requieren vigilancia estrecha. Se trata de la pureza de la cultura incluyendo la eliminación de las células gliales en la cultura, la confluencia de la cultura y mantener las células sanas. Presenta variabil…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por Ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá y los institutos canadienses de investigación en salud otorga a A.J.-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
