Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller
Summary
Det här protokollet beskriver en enkel metod för att isolera och odla primära mus cerebral granule nervceller (CGNs) från 6-7 dag gammal PUP, effektiv cellsignalering av CGNs för förlust och vinst av funktion studier, och modellering NMDA-inducerad neuronala excitotoxicitet, låg-kalium-inducerad celldöd, DNA-skador och oxidativ stress med hjälp av samma kultur-modellen.
Abstract
Cerebellär granule neuroner (CGNs) är en vanligt förekommande neuronala modell, bildar en riklig homogen population i lillhjärnan. Mot bakgrund av deras postnatal utveckling, överflöd och tillgänglighet är CGNs en idealmodell att studera neuronala processer, inklusive neuronal utveckling, neuronala migration och fysiologiska neuronal aktivitet stimulering. Dessutom ger CGN kulturer en utmärkt modell för att studera olika lägen av celldöd inklusive excitotoxicitet och apoptos. Inom en vecka i kultur express CGNs N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer, en specifik jonotropa glutamat receptor med många kritiska funktioner i neuronala hälsa och sjukdom. Tillägg av låga koncentrationer av NMDA tillsammans med membran depolarisation till gnagare primära CGN kulturer har använts för att modellera fysiologiska neuronal aktivitet stimulering medan tillägg av höga koncentrationer av NMDA kan användas för att modellera excitotoxic neuronal skada. Här beskrivs en metod för isolering och odling av CGNs från 6 dagar gamla ungar samt genetisk manipulering av CGNs av adenoviruses och lentiviruses. Vi också närvarande optimerade protokollen om hur man kan stimulera NMDA-inducerad excitotoxicitet, låg-kalium-inducerad apoptos, oxidativ stress och DNA-skada efter transduktion av dessa nervceller.
Introduction
Cerebellär granule nervceller (CGNs) är väl karakteriserade i kultur och har tjänat som en effektiv modell för att studera neuronala dödsfall och utveckling 1,2,3,4,5, 6. ett tidigt uttryck för N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer i CGN kulturer in vitro- gör dem en attraktiv modell att studera NMDA-inducerad signalering. Aktivering av dessa receptorer med NMDA tillsammans med membran depolarisation används för att modellera fysiologiska neuronal aktivitet stimulering och har tillåtit för forskning i mekanismerna bakom synaptisk plasticitet 7,8. Tvärtom, kan över-stimulering av receptorerna av NMDA ligand användas att modellera excitotoxicitet, en viktig mekanism av neuronala förlust i akuta hjärnskador och neurodegenerativa sjukdomar 9. En mekanism för induktion av excitotoxicitet är genom ATP svält med nedsatt syre, som sett med akut neuronal skada. Detta resulterar i membran depolarisation och förhöjda nivåer av glutamat släpp på synapsen. Den efterföljande överstimulering av NMDA-receptorn av förhöjda glutamat leder till överdriven Ca2 + inflödet via dessa receptorer, som i sin tur aktiverar flera vägar, inklusive Ca2 +-aktiverade proteaser, phospholipases, och endonucleases, vilket resulterar i okontrollerad nedbrytning av viktiga cellulära komponenter och celldöd. Dessutom leder höga intracellulära Ca2 + till produktion av fria syreradikaler och mitokondriell skada 10,11.
Medan majoriteten av neuronala förlust efter NMDA-inducerad neuronala excitotoxicitet är på grund av kalcium inflöde och Bax/Bak oberoende, uteslutas andra mekanismer för celldöd från denna modell. Utseendet på både nekrotisk och apoptotisk celldöd på grund av excitotoxicitet är delvis på grund av generationen av reaktiva syreradikaler (ROS) och DNA-skador som orsakas avhöga intracellulära Ca 2 + nivåer 12. DNA-skador leder till neuronala döden genom apoptotiska mekanismer, är korrelerade med kännetecken för apoptotisk celldöd, såsom uppkomsten av kromatin massorna och apoptotiska kroppar. Induktion av apoptos medieras genom frisättning av cytokrom c från mitokondrierna, och har visat sig vara beroende av Bax/Bak oligomerisering 13. Bax/Bak oligomerisering främjar pore-formationen i yttre mitokondriella membranet, vilket resulterar i cytokrom c release och aktivering av pro-apoptotiska regulatorer som sett med mild ischemisk skada 14.
Generation av ROS är ett betydande problem i hjärnan på grund av de låga endogena nivåerna av antioxidanter, tillsammans med stora syre kravet för neuronala fungerande 15. När de utsätts för en ischemisk händelse, är kväveoxid syntas uppreglerad, producerar kväveoxid och ökar reaktivt syre arter 14. Den öka koncentrationen av syreradikaler kan resultera i DNA-skador och indirekt orsaka energi svält. Höga nivåer av DNA dubbelsträngat raster avhjälps genom aktivering av poly ADP-ribos polymeras-1 (PARP-1), en eukaryota kromatin-bundna protein ansvarar för katalysera överföringen av ADP-ribos enheter från NAD+, en integrerad del av processen DNA reparation 16. Men, med skador på grund av oxidativ stress, PARP-1 aktivering kan orsaka energi svält på grund av ökad avloppet på NAD+, nödvändiga substrat för ATP produktionen genom oxidativ fosforylering. Slutändan, oxidativ stress utlöser apoptos i ett Bax/Bak beroende sätt leder till mitokondriell cytokrom c release och har visats inducera mitokondriell remodelling CGNs 17.
Slutligen, förändringar i koncentrationen av kaliumklorid (KCl) i CGN kulturer kan användas att modellera lågt kalium/depolarisation medierad apoptos 18,19,20. När de utsätts för låga nivåer av K+, genomgå CGNs olika fysiologiska förändringar, vilket resulterar i minskningar av både mitokondrie andning och glykolys, tillskrivas minskad cellulär efterfrågan 21, samt minskning av nivåerna av nuclear factor-κB (NFκB) som reglerar aktiviteter inklusive inflammation och synaptisk transmission 22. Denna modell är av särskilt intresse för studier av celldöd under neuronal utveckling. Lågt K+ miljö närmare liknar fysiologiska förhållanden, och orsakar kännetecken för celldöd sett under neuronal utveckling 23.
Sammanfattningsvis ger CGNs en långvariga modell för att undersöka de underliggande molekylära mekanismerna av neuronala dödsfall och degeneration. Följande protokoll gör att isolering och odling av CGNs, uttryck eller förtryck av en viss genetisk väg med virus och induktion av neuronala dödsfall via olika mekanismer som representerar neuronal skada och degeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här tillhandahåller vi en enkel metod för odling av primära mus cerebellär granule nervceller (CGNs), förlust och vinst av funktion studier och modellering olika mekanismer för celldöd. Flera faktorer påverkar reproducerbarheten för resultaten med denna procedur som kräver noggrann övervakning. Dessa inkluderar renheten av den kulturen inklusive eliminering av gliaceller i kultur, sammanflödet av kultur, och att upprätthålla friska celler. Att införa variabilitet i dessa faktorer kan bias resultaten och u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av naturvetenskap och Engineering Research Council of Canada och den kanadensiska institut för hälsa forskning bidrag till A.J.-A.
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
