Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon
Summary
Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.
Abstract
Serebellar granül nöronlar (CGNs) bol bir homojen nüfus beyincik içinde şekillendirme bir sık kullanılan nöronal model vardır. Onların doğum sonrası gelişim, bereket ve erişilebilirlik ışığında CGNs nöronal süreçler, nöronal gelişim, nöronal göç ve fizyolojik nöronal aktivite stimülasyon gibi eğitim için ideal bir model vardır. Ayrıca, CGN kültürler hücre ölümü excitotoxicity ve Apoptozis dahil olmak üzere farklı modları eğitim için mükemmel bir model sağlar. Kültür bir hafta içinde CGNs N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptörleri, birçok kritik işlevleri nöronal sağlığı ve hastalıkları ile belirli ionotropic Glutamat reseptör hızlı. NMDA düşük konsantrasyonlarda membran depolarizasyon kemirgen birincil CGN kültürleri ile birlikte ek NMDA yüksek konsantrasyonda ilavesi modellemek için istihdam edilebilir iken fizyolojik nöronal aktivite stimülasyon model oluşturmak için kullanılan excitotoxic nöronal yaralanma. Burada, bir yöntem tecrit ve 6 gün eski pups yanı sıra CGNs genetik manipülasyon adenovirüse bakın ve lentiviruses tarafından CGNs kültür açıklanmıştır. Biz aynı zamanda NMDA kaynaklı excitotoxicity, düşük potasyum indüklenen apoptosis, oksidatif stres ve bu nöronların iletim takip DNA hasarı teşvik konusunda mevcut en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları.
Introduction
Serebellar granül nöronlar (CGNs) de kültür karakterize edilmektedir ve nöronal ölüm ve geliştirme 1,2,3,4,5, çalışmaya etkili bir model olarak hizmet etmiş 6. CGN kültürler vitro N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptörlerinin erken ifade onları NMDA kaynaklı sinyalizasyon eğitim için çekici bir model yapar. Etkinleştirme membran depolarizasyon ile birlikte NMDA ile bu reseptörlerinin fizyolojik nöronal aktivite stimülasyon model oluşturmak için kullanılan ve sinaptik plastisite 7,8mekanizmaları araştırma için izin verdi. Aksine, bu reseptörler NMDA ligand tarafından aşırı uyarılması excitotoxicity, akut beyin hasarı ve nörodejeneratif hastalıklar 9nöronal kaybın büyük bir mekanizma modellemek için kullanılabilir. Excitotoxicity indüksiyon için bir mekanizma ATP açlık düşük oksijen ile akut nöronal yaralanma ile görüldüğü gibi geçer. Bu membran depolarizasyon sonuçlanır ve Glutamat yüksek seviyede sinaps bırakın. NMDA reseptör Ca2 +dahil olmak üzere çeşitli yollar teslim etkinleştiren aşırı Ca2 + akını bu reseptörler yoluyla yükseltilmiş Glutamat sonuçlarına göre sonraki uyarım-proteaz, phospholipases, harekete geçirmek ve endonucleases, kritik hücresel bileşenleri ve hücre ölümü kontrolsüz bozulması sonucu. Ayrıca, yüksek intrasellüler Ca2 + oksijen serbest radikallerin ve mitokondrial hasar 10,11nesil açar.
Nöronal kayıp nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı takip çoğunluğu kalsiyum akını nedeniyle ve Bax/Bak bağımsız iken, diğer mekanizmaları hücre ölümü bu modelden dışarıda bırakılamaz. Nekrotik her ikisi de görünümünü ve apoptotik hücre ölümü excitotoxicity nedeniyle kısmen nedeniyle üretimiyüksek intrasellüler Ca 2 + düzeyleri 12tarafından neden olduğu DNA hasar Reaktif oksijen türleri (ROS) ve sanki. DNA hasarı apoptotik mekanizmalarıyla, apoptotik hücre ölümü, Kromatin kitleler ve apoptotik organları görünümünü gibi işaretlerinden ile ilişkili nöronal ölümle sonuçlanır. Apoptozis indüksiyon mitokondri sitokrom c sürümünden üzerinden aracılı ve Bax/Bak Oligomerizasyonda 13tarihinde bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bax/Bak Oligomerizasyonda sitokrom c yayın ve hafif iskemik yaralanma 14ile görüldüğü gibi pro-apoptotik düzenleyicileri aktivasyonu sonuçlanan dış mitokondrial membran gözenek oluşumu teşvik etmektedir.
ROS nesil endojen antioksidanlar, nöronal işleyen 15büyük oksijen gereksinimini ile birleştiğinde seviyesinin düşük nedeniyle beyinde önemli bir konudur. İskemik olay olarak maruz, nitrik oksit sentaz nitrik oksit üreten ve Reaktif oksijen türleri 14artan upregulated olur. Oksijen radikalleri artan konsantrasyon DNA zarar görmesine neden ve dolaylı olarak neden enerji açlık. DNA çift iplikçikli sonları yüksek düzeyde Poli ADP-riboz polimeraz-1 (PARP-1), bir ökaryotik Kromatin bağlı protein ADP-riboz birimleri transferi NAD+bir işlemi için ayrılmaz kataliz için sorumlu aktivasyonu tarafından giderildiği DNA onarım 16. Ancak, oksidatif stres nedeniyle aşırı hasar ile PARP-1 etkinleştirme enerji açlık nedeniyle artan drenaj NAD+, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimi için gerekli bir substrat neden olabilir. Sonuçta, oksidatif stres apoptosis mitokondrial sitokrom c serbest bırakmak için önde gelen bir Bax/Bak bağımlı şekilde tetikler ve mitokondriyal CGNs 17‘ remodeling neden olduğu gösterilmiştir.
Son olarak, Potasyum klorür (KCl) CGN kültürlerde konsantrasyon değişiklikleri düşük potasyum/depolarizasyon aracılı apoptosis 18,19,20modellemek için kullanılabilir. K+düşük düzeylere maruz kaldığında, CGNs mitokondrial solunum ve azalan hücresel talep 21‘ e, atfedilen Glikoliz, indirim yanı sıra düzeyde azalma sonuçlanan farklı fizyolojik değişiklikleri meydana Nükleer faktör-hareket enflamasyon ve sinaptik iletimi 22dahil düzenleyen κB (NFκB). Hücre ölümü nöronal gelişim sırasında çalışma için özel ilgi bu modeldir. Düşük K+ ortamı daha yakından fizyolojik şartlarda benzer ve hücre ölümü nöronal gelişim 23sırasında görülen işaretlerinden neden olur.
Özetle, CGNs nöronal ölüm ve dejenerasyon temel moleküler mekanizmaları incelemek için uzun süredir devam eden bir model sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralı yalıtım ve CGNs, ifade veya virüs ve nöronal ölüm nöronal yaralanma ve dejenerasyon gösteren farklı mekanizmalar aracılığıyla indüksiyon kullanarak belirli bir genetik yolu bir baskı kültür sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada biz birincil fare serebellar granül nöronlar (CGNs), kar ve zarar işlevi çalışmalar Kültür ve hücre ölümü farklı mekanizmaları modelleme için basit bir yöntem sağlar. Çeşitli faktörler yakın izleme gerektiren bu yordamı kullanarak sonuçları tekrarlanabilirlik etkiler. Bu kültür, kültür, izdiham gliyal hücrelerini ortadan kaldırılması da dahil olmak üzere ve sağlıklı hücrelerin Bakımı kültür saflığı içerir. Bu faktörler değişkenlik tanıtan sonuçları önyargı ve te…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada tarafından desteklenir ve Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri AJ-A. için verir
Materials
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
Referências
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D’Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
