Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Claudia A. Sim&#245;es-Pires; Vincent Zwick; Sylvian Cretton; Muriel Cuendet

doi:10.3791/55878

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Química

Одновременное измерение HDAC1 и HDAC6 активности в НеЬа клетки с помощью UHPLC-MS

Published: August 10, 2017

doi:

10.3791/55878

Claudia A. Simões-Pires*¹, Vincent Zwick*¹, Sylvian Cretton, Muriel Cuendet

¹Section des Sciences Pharmaceutiques,Universités des Geneva–Lausanne (EPGL)

Summary

Нынешний метод служит для идентификации изоформы специфичные Ингибиторы гистоновых комплексы (HDAC) в клетки HeLa UHPLC-MS анализ нескольких субстратов. Это антитела, свободной метод разработан для отражения активности HDAC1 и HDAC6 в живых клеток окружающей среды, в отличие от одного изоформы клеток бесплатные анализы.

Abstract

Поиск новых Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) имеет повышенный интерес в лекарственных препаратах. Избирательность изоформы был в центре внимания после утверждения romidepsin, класс я HDAC ингибиторов для терапии рака и клиническое исследование HDAC6-специфические ингибиторы множественной миеломы. Нынешний метод используется для определения ингибиторная активность соединений тест на HDAC1 и HDAC6 в клетках. Изоформы активность измеряется с помощью жидкостной хроматографии ультра-высокой производительности – масс-спектрометрия (UHPLC-МС) анализ конкретных субстратов, инкубировали с обработанных и необработанных НеЬа клетки. Этот метод имеет преимущество отражающие действие эндогенного HDAC в среде клетки, в отличие от свободных клеток биохимических анализов, проведенных на отдельных изоформ. Кроме того потому что он основан на количественной оценке синтетических субстратов, метод не требует признания антитела эндогенного ацетилированный белков. Он легко адаптируется к несколько клеточных линий и автоматизированный процесс. Этот метод уже оказался полезным в поиске HDAC6-селективные соединений в нейробласты. Представитель результаты отображаются здесь с стандартным HDAC ингибиторов трихостатин (неспецифические), MS275 (HDAC1-специфические), и tubastatin (HDAC6-специфические) с использованием клеток HeLa.

Introduction

Гда принадлежат к семейству ферментов, возможность deacetylate гистонами в структуре хроматина. Они также имеют другие белковых субстратов в цитозоле и расположены в различных клеточных компартментов. В общей сложности 18 HDAC изоформ до настоящего времени были определены и были связаны с нескольких клеток механизмов, включая регулирование факторов транскрипции и экспрессии генов, а также сигнализации ячейки и транспорта¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Каталитического ингибиторы ГДАЦ появились как потенциальных лекарственных препаратов для терапии рака. Большинство ингибиторы ГДАЦ, в настоящее время одобрен FDA для лечения Т-клеточной лимфомы и множественной миеломы и ингибиторы ГДАЦ неспецифической, например vorinostat (Саха), belinostat и panobinostat⁸^,⁹. Однако целый ряд побочных эффектов были связаны с Пан ингибиторы, и поиск для конкретных изоформы малых молекул является горячей темой в лекарственных химии и наркотики discovery. Соответственно, класс I (HDAC1-3 и HDAC8) селективный ингибитор romidepsin является уже утвержденных наркотиков¹⁰, HDAC6-специфические ингибиторы в настоящее время в клинических испытаниях, с повышенной терапевтический потенциал множественной миеломы¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵.

Скрининг анализов характеризовать HDAC ингибиторов основаны на инкубацию HDAC субстрата с источником ферментативный (один изоформы, ядерной экстракт или lysate клетки). Субстрат, как правило небольших пептидных последовательность, содержащую ацетил лизин остатков в сочетании с горные Флюорофор (например, кумарина), например N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)¹⁶. Различать изоформы конкретных мероприятий, отдельных свободных клеток с участием каждого изоформы необходимы и могут не отражать реальный изоформы активность в живых клетках. Изоформы специфических субстратов коммерчески доступны, такие как бензил (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 конкретного субстрата) и (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic кислота трет бутилового эфира (BATCP, HDAC6 конкретного субстрата) (рис. 1B). Однако, мульти субстрат смесь, содержащую мал, MOCPAC и BATCP для живых клеток не допустит обнаружения отдельных deacetylated продуктов флуориметрический измерения, учитывая, что они несут же горные Флюорофор.

Метод, описанный здесь позволяет для обнаружения и относительной количественная оценка каждого субстрата и его deacetylated продукта в НеЬа клетки с использованием мульти субстрат пробирного следуют UHPLC-ЭСИ-MS/MS анализ¹⁷. HDAC assay проводится на клетки HeLa для прямой идентификации HDAC ингибиторная активность и специфичность тест соединений на эндогенных гда. Существует акцент на HDAC1 и HDAC6, которые оцениваются одновременно. Для достижения этих ферментативные измерений в одном инкубации assay, смесь неспецифические и специфические субстраты HDAC добавляется обработанных и необработанных клетки HeLa, покрытием на 96-луночных тарелку. После инкубации шаг клетки являются лизированы выпустить субстратов и продукты их соответствующей реакции, которые разделены и обнаружить с помощью метода UHPLC-мс (рис. 1 c). Deacetylated мал, MOCPAC и BATCP субстратов продукция deacetylated мал (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) и deacetylated BATCP (dBATCP), соответственно. Доза реакция кривых могут быть построены с активных соединений.

Рисунок 1: Общая схема на основе ячеек HDAC проба для выявления HDAC1 и HDAC6-специфичные ингибиторы UHPLC-MS анализ нескольких субстратов. (A) схема типичной 96-луночных пластины, содержащей лечение (тест соединения) и клетки HeLa неочищенные (управления), а также пустые ячейки бесплатно. (B) Химическая структура субстратов, добавляется как смесь (по 21 мкм) быть deacetylated путем эндогенного гда. (C) типичный UHPLC-MS Хроматограмма показаны вершин добавлена субстратов (MAL, MOCPAC и BATCP) и их deacetylated продуктов (dMAL, dMOCPAC и dBACTP, соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. клеточная культура Примечание: Следующие шаги выполняются в стандартной культуры ткани капюшоном. Знакомство с стерильных ожидается. Культура клетки HeLa в 80% confluency в колбе культуры клеток T75 в MEM, дополнена 10% плода бычьим сывороточным, пенициллина G (100 ед/мл) и стре?…

Representative Results

Чтобы продемонстрировать применение метода для выявления неизбирательной и выборочной ингибиторов для HDAC1 (класс I) и HDAC6 (класс IIb), клетки НеЬа были относиться с известных стандартных соединений: трихостатин A (неизбирательной между HDAC1 и HDAC6)18, MS275 (HDAC1-селе?…

Discussion

Ингибирование HDAC является горячей темой в лекарственных препаратах, с текущей упором на HDAC6-селективных ингибиторов для рака терапии²¹. HDAC селективность обычно оценивается серия высокой пропускной способностью, клетки бесплатные анализы, которые намерены определить инги?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают стоимость действий CM1406 (эпигенетическими химической биологии). Исследования в этой публикации была поддержана Фондом Пьер Мерсье.

Materials

BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubastatin A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific	10660131
Formic acid, LC/MS grade	Fisher Scientific	10596814
H₂O, HPLC grade			distilled H₂O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cells	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, cell culture grade	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Penicillin-Streptomycin	Bioconcept	4-01F00-H
10X RIPA buffer	Abcam	ab156034
SigmaFast protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	S8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning	VWR	29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning	VWR	29442-404	used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatible with the Acquity UHPLC system
T75 cell culture flasks Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Peelable heat sealing foil	Waters	186002789
Acquity UPLC system	Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1	Waters		Catalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240	Waters		Catalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters		Catalog number not available

Referências

Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?. Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211)
. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012)
. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013)
. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015)
Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).
Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
Copeland, R. A. . Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Simões-Pires, C. A., Zwick, V., Cretton, S., Cuendet, M. Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS. J. Vis. Exp. (126), e55878, doi:10.3791/55878 (2017).