प्रतिदीप्ति में-सीटू संकरण (मछली) अक्सर व्यक्तिगत चिकित्सा में चिकित्सा के चयन के लिए histopathology और आणविक निदान के साथ संयोजन में आवश्यक है । एक उपंयास गैर पार से जोड़ने, formalin मुक्त ऊतक निर्धारण है कि उच्च गुणवत्ता सुघड़, आणविक और मछली एक ही नमूना से विश्लेषण के अलावा एक पोस्ट-निर्धारण कदम से पहले मछली प्रस्तुत किया जाता है की अनुमति देता है ।
formalin के सुघड़ आकलन-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक के नमूनों के कारण दशकों के लिए कैंसर निदान के लिए स्वर्ण मानक आकृति विज्ञान के उत्कृष्ट संरक्षण के लिए किया गया है । निजीकृत दवा तेजी से व्यक्तिगत अनुकूलित और लक्षित चिकित्सा संयुक्त रूपात्मक और आणविक विश्लेषणात्मक प्रौद्योगिकियों और निदान द्वारा सक्षम विशेषता व्यक्तिगत रोगों के लिए प्रदान करता है । एक ही FFPE नमूना से सुघड़ और आणविक परख का प्रदर्शन रासायनिक संशोधन और न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के पार से जोड़ने के कारण formalin के नकारात्मक प्रभाव के कारण चुनौतीपूर्ण है । एक गैर-पार से जोड़ने, formalin-मुक्त ऊतक निर्धारण हाल ही में दोनों आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विकसित किया गया है, अर्थात्, क्रायो-संरक्षण जैसे FFPE और अणुओं की तरह आकृति विज्ञान की रक्षा के लिए. के बाद से मछली अक्सर histopathology और आणविक निदान के साथ संयोजन में आवश्यक है, हम इस नए निर्धारण के साथ इलाज के ऊतकों पर मछली प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का परीक्षण किया । हमने पाया है कि गैर-पार formalin के ऊतकीय वर्गों के बाद निर्धारण, formalin मुक्त और आयल-एंबेडेड (NCFPE) स्तन कैंसर ऊतक मानव FFPE वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 में एपिडर्मल ऊतक के साथ उन लोगों के लिए समकक्ष परिणाम उत्पंन (HER2) मछली विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक मछली परख मूल रूप से विकसित और FFPE ऊतक के लिए मांय ऊतकीय वर्गों के एक साधारण पद निर्धारण कदम से NCFPE ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
निजीकृत दवा तेजी से बहु-पैरामीटर रूपात्मक और आणविक ऊतक विश्लेषण को शामिल परीक्षणों पर निर्भर करता है । सोने के मानक के रूप में ऊतकों के Formalin निर्धारण उत्कृष्ट सुघड़ गुणवत्ता1,2प्रदान करता है । हालांकि, formalin-प्रेरित रासायनिक संशोधन और पार प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की3,4,5 नकारात्मक आणविक विश्लेषण6के साथ हस्तक्षेप । इन आणविक संशोधनों न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की गुणवत्ता की सीमा और जीन अनुक्रम कलाकृतियों में परिणाम हो सकता है7 या पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के कम संवेदनशीलता-परख8आधारित । हालांकि FFPE ऊतक के लिए आणविक परीक्षणों का अनुकूलन करने के लिए प्रमुख प्रयास किए गए थे, ऊतकों के क्रायो-संरक्षण formalin निर्धारण करने के लिए बेहतर सामान्य में है, यह विभिन्न संरक्षण प्रक्रियाओं के लिए ऊतक के नमूनों को विभाजित करने के लिए आवश्यक बना रही है. आणविक विश्लेषणों के लिए क्रायो-संरक्षण की आवश्यकता से बचने के लिए एक गैर-पार से जोड़ने वाला, formalin-मुक्त निर्धारण, PAXgene ऊतक विकसित किया गया. यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली एक निर्धारण और विभिंन अल्कोहल, एसिटिक एसिड और एक घुलनशील कार्बनिक यौगिक युक्त एक स्थिरीकरण समाधान के होते हैं । न्यूक्लिक एसिड का उचित संरक्षण, (phospo) प्रोटीन और आकृति विज्ञान कई अध्ययनों में दिखाया गया था6,9,10,11,12,13.
कैंसर निदान में एक विशेष आवेदन मछली इस तरह के अनुवादन, सूक्ष्म विलोपन और प्रवर्धन 14के रूप में गुणसूत्र परिवर्तन, की एक व्यापक रेंज का पता लगाने है । उदाहरण के लिए, आक्रामक स्तन कैंसर ट्यूमर के बीस प्रतिशत मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 के प्रवर्धन (HER2) जीन15,16,17, जो गरीब रोग का निदान 18 के साथ जुड़ा हुआ है ,19. HER2 के निर्धारण और स्तन कैंसर में प्रवर्धन स्थिति मछली द्वारा संकल्प विरोधी HER2 के लिए रोगियों का चयन करने की जरूरत है-चिकित्सा निर्देशित और एक साथी नैदानिक फेडरल ड्रग एसोसिएशन (एफडीए) द्वारा सूचीबद्ध है (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. आदेश में मछली के एक व्यापक आवेदन स्वास्थ्य देखभाल में आधारित साथी निदान की अनुमति के लिए, परख विकसित और FFPE ऊतकों के लिए अनुमोदित किया गया ।
पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला है कि NCFPE ऊतकों मछली परख जो FFPE ऊतक के लिए अनुमोदित किया गया है के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । हालांकि, 4% के साथ NCFPE ऊतकों के विभिंन पोस्ट निर्धारण प्रक्रियाओं की समय श्रृंखला के परीक्षण बफ़र्ड formaldehyde से पता चला कि पद निर्धारण 18 ज या NCFPE ऊतक वर्गों के लंबे समय के FFPE ऊतकों के साथ उन लोगों के लिए समकक्ष परिणाम प्राप्त14।
इस अध्ययन में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एक ही प्राथमिक ऊतक नमूना से HER2 मछली और आरएनए गुणवत्ता के लिए इस्तेमाल किया वर्गों पर गैर-पार से जोड़ने, formalin-मुक्त ऊतक निर्धारण और 24 ज 4% बफर formaldehyde पद निर्धारण के प्रभाव का प्रदर्शन.
चित्रा 1: प्रतिदीप्ति के लिए कदम दिखा आरेख सीटू संकरण (मछली) और आरएनए विश्लेषण formalin फिक्स्ड आयल एंबेडेड (FFPE) और गैर-पार से जोड़ने, formalin मुक्त फिक्स्ड आयल एंबेडेड (NCFPE) ऊतकों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
परिणाम दो प्रमुख निष्कर्षों को प्रदर्शित करता है । सबसे पहले, एक साधारण 24 ज SBFS NCFPE ऊतकों से कटौती वर्गों के बाद निर्धारण कदम मछली विश्लेषण में FFPE के साथ उन लोगों के लिए समकक्ष परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है मछली FFPE ऊतकों के लिए अनुमोदित परख का उपयोग कर (भी संदर्भ देखें14) । इस प्रोटोकॉल मछली परख मूल रूप से विकसित और व्यापक पुनर्मान्यीकरण के लिए की आवश्यकता के बिना FFPE के लिए मंजूरी दे दी का उपयोग करने का लाभ है (जैसे, गैर के लिए पूर्व संकरण शर्तों-पार से जुड़े ऊतक के अनुकूलन द्वारा) । मछली प्रोटोकॉल बिल्कुल निर्माता के निर्देशों में वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
निर्माता ´ s निर्देश से मामूली संशोधन इस प्रोटोकॉल में वर्णित (जैसे ऊतक अनुभाग व्यास और deparaffinization चरणों में गर्मी की अवधि) पिछले रूपांतरों, जो स्पष्ट रूप से निर्माता द्वारा सिफारिश की है से परिणाम विभिन्न ऊतक प्रकार और निर्धारण विधियों के उपयोग के कारण.
पोस्ट-निर्धारण कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह 18-24 एच के एक रासायनिक प्रतिक्रिया समय की आवश्यकता है, जो एक दिन के द्वारा विश्लेषण समय प्रदान करता है, लेकिन एक ही दैनिक कार्यप्रवाह FFPE ऊतकों के लिए विकसित के रूप में (चित्रा 1) की अनुमति देता है । SBFS 1 मिमी प्रति घंटे22 से 5 मिमी में ऊतक के प्रकार23,24के आधार पर 2 एच के लिए एक औसत दर से ऊतक घुसना करने के लिए सूचित है । निरीक्षण है कि केवल लंबे समय से अधिक 18 से अधिक की अवधि के बाद निर्धारण FFPE वर्गों के लिए NCFPE के गुणों को बदल सकता है, इंगित करता है कि नहीं, निर्धारण की पैठ लेकिन रासायनिक प्रतिक्रिया समय वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है1 ,14.
दूसरा, शेष NCFPE ऊतक है कि पद के निर्धारण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है और आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अधिक से अधिक अणुओं अच्छी तरह से संरक्षित हैं । इस वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (चित्रा 3) द्वारा प्रदर्शन किया गया । परख electropherogram से अधिक संवेदनशील और विशिष्ट है (आरएनए अखंडता संख्या) आरएनए गुणवत्ता के संबंध में (यानी, रासायनिक संशोधन और विखंडन) आयल-एंबेडेड ऊतकों से पृथक mRNA के लिए8। गुणवत्ता नियंत्रण वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस अध्ययन में प्रतिबंधित किया गया था के बाद से स्वतंत्र समूहों से पता चला है कि आरएनए के अलावा, डीएनए और NCFPE से अलग प्रोटीन की गुणवत्ता है कि FFPE ऊतकों से बेहतर है 8,9, 13.
इस प्रकार प्रस्तुत प्रोटोकॉल, जहां लागू (जैसे, SBFS नुस्खा, निर्धारण की स्थिति, आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण, सत्यापन), पूर्व विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए केंद्र तकनीकी विनिर्देशों की आवश्यकताओं के लिए इन -विट्रो निदान (IVD), जो हाल ही में मानकीकरण (केंद्र) की यूरोपीय समिति द्वारा जारी किया गया है (के लिए केंद्र/टीएस 16827-1:2015 आरएनए-FFPE ऊतकों जो आईएसओ १५१८९ मानक को संदर्भित करता है से अलगाव के लिए) ।
विधि इस विशिष्ट निर्धारण तक सीमित है । हालांकि गैर-पार-जोड़ने, formalin-मुक्त निर्धारण का उपयोग करने वाले जैव अणुओं और आकृति विज्ञान का अच्छा संरक्षण कई अध्ययनों में प्रस्तुत किया गया है, यह मुख्य रूप से अनुसंधान में नहीं बल्कि नियमित चिकित्सा अनुप्रयोगों में प्रयोग किया जाता है । एक कारण यह है कि एक और निर्धारण द्वारा सोने के मानक SBFS निर्धारण की जगह नहीं सभी FFPE सामग्री के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल के रूप में मांयता के अध्ययन की एक किस्म की आवश्यकता होगी गैर के साथ तय सामग्री-पार-fixatives जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय ऊतक निर्धारण विधियों इस मछली प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण नहीं किया गया ।
साधारण पद-निर्धारण इस पांडुलिपि में वर्णित कदम FFPE और NCFPE ऊतकों के लिए दोनों IVD अनुमोदित परख का उपयोग करने का लाभ है ।
The authors have nothing to disclose.
हम अपनी विशेषज्ञता और समर्थन के लिए चिकित्सा विश्वविद्यालय चराई की विकृति के संस्थान में आणविक विकृति के लिए प्रयोगशाला की टीम को धंयवाद । इसके अलावा, हम Rieger Eidenhammer (पैथोलॉजिस्ट) और तमस HER2 (Kinga) की प्रोसेसिंग के लिए तकनीकी सहायता, Bernadette Szurian और सिल्विया Regényi के लिए आइरिस Kufferath और डैनिएला Pabst को धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि की अशुद्धि जांच के लिए पेनेलोप Kungl धंयवाद । यह काम किया गया है वित्तीय क्रिश्चियन डॉपलर अनुसंधान कोष, ऑस्ट्रिया के संघीय विज्ञान, अनुसंधान और अर्थव्यवस्था और राष्ट्रीय अनुसंधान, प्रौद्योगिकी और विकास के लिए फाउंडेशन के मंत्रालय द्वारा समर्थित है ।
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ThermoFisher Scientific | www.thermofisher.com | 4367659 | PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons. |
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