Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela RIP-Tag; RIP-tva modelo murino

Resumo

Apresentamos um protocolo para demonstrar um sistema de transferência de gene somática romance utilizando RIP-Tag; RIP-tva modelo do rato para estudar a função dos genes em metástase. Os retrovírus aviária são entregues intracardiacally para garantir a transferência de genes em lesões pré-malignas, não-invasivas de células β do pâncreas em ratos adultos.

Resumo

Cancro metastático é responsável por 90% das mortes em pacientes com tumores sólidos. Há uma necessidade urgente para compreender melhor os drivers de metástase do cancro e para identificar novos alvos terapêuticos. Para investigar os eventos moleculares que conduzem a progressão do câncer primário a metástase, desenvolvemos um modelo do rato de bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva. Neste modelo de rato, o promotor de insulina de rato (RIP) conduz a expressão do antígeno T SV40 (Tag) e o receptor para o subgrupo um vírus da leucose aviária (tva) nas células β do pâncreas. Os ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas com penetrância de 100% através de etapas bem definidas que são semelhantes a tumorigênese humana, com etapas, incluindo hiperplasia, angiogênese, adenoma e carcinoma invasivo. Porque RIP-Tag; RIP-tva ratos não desenvolvem a doença metastática, alterações genéticas que promovem a metástase podem ser identificadas facilmente. Gene somática transferir para expressar a tva, proliferando β do pâncreas lesões pré-malignas é conseguida através de Injeção intracardíaca de retrovírus aviária, abrigando a alteração genética desejada. Um título de > 1 x 10⁸ infecciosas unidades / ml é considerado apropriado para a infecção na vivo . Além disso, o retrovírus aviária podem infectar linhas de células derivadas de tumores em RIP-Tag; RIP-tva mouses com alta eficiência. As linhas de célula também podem ser usadas para caracterizar os fatores metastáticos. Aqui vamos demonstrar como utilizar este modelo de rato e linhas para avaliar as funções dos genes candidatos em metástase de tumor de células.

Introdução

A maioria dos cânceres resultam de mutações somáticas ¹. Modelos de mouse convencional geneticamente modificados (GEMM) forneceu insights significativos sobre a contribuição de alterações genéticas específicas a tumorigênese ². No entanto, eles têm várias limitações. A grande desvantagem destes modelos é que eles não replicar a natureza esporádica da formação de tumor em seres humanos, em que apenas algumas células dentro de um tecido adquirem alterações genéticas. As mutações em camundongos transgênicos e nocaute também são germline com potencial de afetar o desenvolvimento. Além disso, gerar estes modelos do rato é car....

Protocolo

declaração de ética: experimentos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Instituto de cuidado Animal e Comitê de uso de Weill Cornell medicina.

1. escolha de vetores retrovirais aviária (base RCASBP ou RCANBP(A)-based)

• vetores foi derivado de vírus do sarcoma de Rous ¹¹. Vetores retrovirais aviária podem entregar os cDNAs (≤ 2,5 kb), curto grampo RNAs (shRNAs), microRNAs (miRNAs) e outros RNAs não-codificante. Os vetores comercialmente disponíveis são listados em materiais e outros precisam ser soli....

Resultados

A taxa de infecção in vivo e in vitro de RIP-Tag; RIP-tva células tumorais por vírus baseados em RCASBP ~ 20% e ~ 80% respectivamente são ²⁰. Na RIP-marca de ; RIP-tva modelo do rato, aproximadamente 4% de 400 ilhotas pancreáticas em cada rato desenvolverá naturalmente em tumores ²⁰; Portanto, há uma quantidade suficiente de células tumorais em cada rato para análise histológica e fenotípica do efeito pote.......

Discussão

Neste estudo, descrevemos um modelo poderoso rato, RIP-Tag; RIP-tva, para conseguir a entrega do gene somática via aviária retrovírus para a identificação e caracterização de fatores metastáticos. Embora RIP-Tag; RIP-tva ratos desenvolvem tumores neuroendócrinos do pâncreas, metastáticos factores identificados neste modelo do rato também podem promover a metástase de outros tipos de câncer.

Nossa abordagem tem a vantagem de introduzir alterações genéticas somáticas especifica.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plasmídeo RCASBP-Y DV	Addgene	11478
RCAS-RNAi plasmídeo	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
soro fetal bovino	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-glutamina, 100x	Corning	25-005-CI
Solução de penicilina-estreptomicina, 100x	Corning	30-002-CI
PBS-/-, 1x	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
Tubo de centrífuga de polialômero	Beckman Coulter	326823
0,45 mm Nalgene Seringas com Membrana PES	Seringas	194-2545
	BD
sinaptofisina	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-6101
AmpliTaq DNA Polimerase com Buffer II	Life Technologies	N8080153
MyTaq DNA Polimerase	Bioline	BIO-21106

de Insulina Thermo Scientific 329461