Здесь мы продемонстрировать новаторский подход к использованию высокого разрешения спектральной области оптическая когерентная томография (HR-SD-Окт) для содействия доставке генной терапии агентов в пространство субретинальное, оценить его ареал освещение и характеризуют фоторецепторных жизнеспособность.
HR-SD-OCT используется для контролировать прогрессирование фоторецепторных дегенерации в прямом мыши модели, оценить доставки терапевтических агентов в субретинальное пространство и для оценки токсичности и эффективность в естественных условиях. HR-SD-Окт использует около инфракрасного света (800-880 Нм) и имеет оптику специально разработан для уникальных оптики глаза мыши с суб-2-микрон осевой резолюции. Трансгенные мыши модели внешних сетчатки (фоторецепторных) вырождение и контроля были образы оценить прогрессирования заболевания. Вытащил стеклянной микроиглы были использованы для доставки суб сетчатки инъекции аденоассоциированный вирус (AAV) или наночастиц (NP) через транс склеры и транс хориоидеи подход. Тщательно позиционировать кончик иглы в пространство субретинальное требовалось до калиброванный инъекция, которая поставляет жидкость в суб сетчатки пространство. Реальном времени субретинальное хирургии было проведено на нашей сетчатки системы (RIS). HR-SD-Окт продемонстрировал прогрессивного единообразных дегенерации сетчатки вследствие выражение токсичных мутант человека мутантов родопсина (P347S) (РоP347S) трансген мышей. HR-SD-OCT позволяет строгой количественной оценки всех слоев сетчатки. Наружный слой ядерной (ONL) толщина и фоторецепторных измерения длины (OSL) наружный сегмент коррелируют с фоторецепторных жизнеспособность, дегенерация или спасения. Система доставки RIS позволяет в реальном времени визуализации субретинальное инъекции в неонатальной (~ P10-14) или взрослых мышей, HR-SD-Окт немедленно определяет успех доставки и карты и ареал степени. HR-SD-Окт является мощным инструментом, который можно оценить успех субретинальное хирургии в мышей, в дополнение к оценке жизнеспособности фоторецепторов в естественных условиях. HR-SD-Сен также может использоваться для определения единообразных животных когорты для оценки степени дегенерация сетчатки, токсичности и терапевтические спасения в доклинических гена терапии научных исследований.
Исследователи разрабатывают генной терапии для различных дегенеративных заболеваний сетчатки и сетчатки с надежды перевода Роман терапии в лечение для болезней человека1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. время домена или спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) был использован для изучения аспектов внешних дегенерации сетчатки в конкретных мыши модели болезни12,13,14 . HR-SD-OCT не, однако, был широко используется в контексте оптимизации оценки моделей мыши для определения темпов и пространственной однородности дегенерации сетчатки, или в контексте доклинических оценки гена на основе терапии, например, к оценить спасения, токсичность или пространственные масштабы векторных доставки8,,1516. После того, как полностью характеризуется модель мыши, HR-SD-Окт данных может служить информативным и надежного ресурса для измерения влияния терапии приложить спасения или токсичности в моделях мыши дегенерации сетчатки17. Многие группы используют субретинальное инъекции как метод доставки векторных благодаря своей эффективности в преобразователя фоторецепторных клеток и клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС). Однако это остается сложным метод мастер, учитывая, что это обычно делается путем операции свободной рукой от поверхности роговицы и часто сопряжено с катарактой, кровотечение и непреднамеренные отслоения сетчатки происходит просто путем манипуляций задней стекловидного тела. Многие группы по-прежнему пытаются субретинальное инъекции слепо и доставить вирус с помощью ручного инъекции с относительно большого диаметра из нержавеющей стали иглы (34G)8,,1718,19 ,20,21,22и несколько использует оптическая когерентная томография (Окт) imaging для подтверждения надлежащего доставки вектора к сетчатке8,17, 20 , 22. Некоторые улучшения в методе недавно были описаны с помощью иглы микромасштабной, движимый микроманипулятор22.
Мы представляем комплексный подход, который помогает в позиционирования иглы, и инъекции способствуют пользовательских режиссер стерео офтальмоскоп, разработанный в лаборатории специально для визуализации внутри небольшой глаз мыши17, 23. Использование микро иглы вытащил стекла в сочетании с стереотаксического микроманипулятор обеспечивают лучшее управление иглы с не хирургическим сократить требуемый (т.е., через хлогексидином и соединительной ткани) до инъекции. Использование давления регулируется микро инжектор помогает доставить последовательного впрыска томов, и инъекции может быть сделано с гораздо большей стабильностью, точность и гораздо медленнее, чем ручной инъекций, выполняемых ручной шприц, снижая возникновение пузырь инъекции в глаз. Меньшие иглу помогает предотвратить утечки после вывода иглы, потому что путь самоуплотняющийся. Для оценки степени инъекция/доставки, многие следственные группы полагаются на поиске и оценке площадной степени расширение зеленый флуоресценции белков (EGFP) в сетчатке (построить выражение выступил вектор) в конце экспериментального точка (эвтаназия) для подтверждения успешного инъекции11,19,20,24. Этот подход (не используя OCT) чтобы убедиться, что хирургические успеха отходов огромное количество ресурсов в хирургической процедуры время и животных, так как все животные с (неизвестных) хирургические ошибки необходимо сохранить, затем с повторяющихся мер до урожай эвтаназии и глаз (когда измеряется EGFP). Подтверждение местоположения инъекций в сетчатке может быть улучшено с помощью HR-SD-Окт продемонстрировать, что инъекции расположен между правильным слоев сетчатки (т.е. субретинальное пространства). HR-SD-Окт может также использоваться для немедленно разграничить неудачных попыток (хирургические ошибки) для выявления соответствующих переменных в реальных хирургические время улучшить подход. Мы обнаружили, что HR-SD-OCT предоставляет многочисленные преимущества в доклинических ген исследования терапии, позволяя быстрое количественной оценки внешних дегенерация сетчатки, позволяя идентификации/забой животных исследования, которые не отвечают критериям экспериментальных ( Например, неправильный субретинальное инъекций) и для прямой последующей визуализации в регион глаза где вектор был доставлен (где доклинические эффект скорее), а также управления регионами, где вектор не было доставлено. С момента своего развития, использование SD-Окт продолжает быть приняты и использованы исследователями офтальмологии и в настоящее время считается стандартом сетчатки отображения сетчатки научных исследований в мышь или грызун модели13,25. HR-SD-OCT и его возможности программного обеспечения были использованы в уникальных комплексных способов достижения цели успешного количественный генной терапии в моделях мыши на каждом шагу в процессе, включая выбор Животные модели, характеристика дегенерации в выбранной модели заболеванием, терапевтические доставки, отображение вектора доставки, и токсичность/эффективность оценки. Использование HR-SD-OCT позволяет для более эффективных лекарственных препаратов на всех уровнях этого процесса. Здесь мы опишем эти подходы, которые используются в нашей программе РНК лекарственных препаратов.
HR-SD-OCT предоставляет простой метод для определения характеристик потенциальных животных моделей болезней человека, чтобы определить их полезность в тестировании потенциальные терапии. Способность быстро и надежно характеризуют потенциальной модели животных болезней человека имеет …
The authors have nothing to disclose.
Этот материал основан на работе, в частности, поддерживается Департаментом по делам ветеранов (VA), ветеранов здравоохранения администрации, управления исследований и развития (биомедицинские лаборатории исследования и развития) (Грант заслуги ва 1I01BX000669). JMS используется, в частности, как врач-научный сотрудник, офтальмологии, ва площадей; MCB используется, в частности, ва площадей. Исследование было проведено на и частично поддерживается система здравоохранения ветеранов администрации Западной Нью-Йорка (Буффало, Нью-Йорк). Содержание не отражает мнения Департамента по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов. Также поддерживается, в основную часть, по NIH/НЭЙ R01 Грант EY013433 (PI: JMS), NIH/НЭЙ R24 Грант EY016662 (UB видение инфраструктуры центр, PI: M убоя, директор – биофотоники модуль: JMS), неограниченный Грант для кафедры офтальмологии/университета в Буффало от исследования, чтобы предотвратить слепоту (Нью-Йорк, Нью -Йорк) и Грант от Фонда Oishei (Буффало, Нью-Йорк). Мы признаем дар Нс1 трансгенных РоP347S линии и мыши экзона 1 Ро нокаут от д-р Янис Lem (медицинский центр Новой Англии Тафтса, Бостон, штат Массачусетс) и дар НПЧ-E трансген модель в состоянии гетерозиготных на мышь экзона 2 Ро нокаут фон от Drs. G. Джейн Фаррар и Питер Humphries (Тринити-колледж, Дублин, IRE).
C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
N129R- | N/A | N/A | |
2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
Forceps | Milton | 18-825 | |
Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
Windows Excel | Microsoft | N/A | |
Adobe Illustrator | Adobe | ||
Scale | Mettler | ||
Scissors | World Precision Instruments | ||
Ear punch | Nat’l band | ||
CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
Heating plate | In House | N/A | |
Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
Contact lenses | In-house | N/A | |
Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |