Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

Resumo

Os avanços recentes na capacidade de manipular geneticamente as linhas celulares somáticas possuem grande potencial para pesquisas básicas e aplicadas. Aqui, apresentamos duas abordagens para CRISPR / Cas9 gerado produção knockout e triagem em linhas de células de mamíferos, com e sem o uso de marcadores selecionáveis.

Resumo

O sistema de engenharia do genoma CRISPR / Cas9 revolucionou a biologia ao permitir uma edição precisa do genoma com pouco esforço. Guiado por um único guia de RNA (sgRNA) que confere especificidade, a proteína Cas9 cliva ambas as cadeias de DNA no locus alvo. A ruptura do DNA pode desencadear união final não homóloga (NHEJ) ou reparação direcionada a homologia (HDR). O NHEJ pode introduzir pequenas deleções ou inserções que levam a mutações de mudança de quadro, enquanto o HDR permite perturbações maiores e mais precisas. Aqui, apresentamos protocolos para geração de linhas celulares knockout através do acoplamento de métodos CRISPR / Cas9 estabelecidos com duas opções para seleção / rastreio a jusante. A abordagem NHEJ usa um único local de corte de sgRNA e rastreio independente de seleção, onde a produção de proteína é avaliada por imunotransferência ponto de uma maneira de alto rendimento. A abordagem HDR usa dois sites de corte de sgRNA que abrangem o gene de interesse. Juntamente com um modelo de HDR fornecido, esse método pode ser excluídoDe dezenas de kb, auxiliado pelo marcador de resistência selecionado inserido. São discutidas as aplicações e vantagens apropriadas de cada método.

Introdução

Alterações genéticas estáveis ​​oferecem uma vantagem sobre os métodos transitórios de perturbação celular, que podem ser variáveis ​​em sua eficiência e duração. A edição genômica tornou-se cada vez mais comum nos últimos anos devido ao desenvolvimento de nucleases específicas do alvo, como as nucleases de zinco-dedo ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , as nucleases efetoras do tipo ativador da transcrição (TALENs) ^{6 , 7 , 8}

Protocolo

1. Identificação de regiões de homologia em torno da eliminação desejada

NOTA: necessário somente se estiver usando a edição baseada em seleção.

1. Selecione duas regiões, inicialmente 1,5-2 kb, em ambos os lados do locus de exclusão desejado, que servirá como braços de homologia no modelo HDR ( Figura 1A ). Identifique as regiões que carecem de sites de reconhecimento BsaI em ambos os lados (GGTCTC) para facilitar a clonagem. Se os sítios BsaI forem inevitáveis, use uma enzima de restrição tipo II diferente (BsmBI, SapI, BbsI) e modifique os locais correspondentes no plasmídeo receptor (pUC19-BsaI), ....

Resultados

Para a geração de linhas knockout ELAVL1, um anticorpo robusto estava disponível, então a edição usando sgRNAs simples ( Figura 1A , esquerda) foi realizada, seguida de imunotransferência por pontos. Três sgRNAs foram transfectados de forma independente para comparar eficiências e descartar os efeitos alvo nos clones resultantes. Após a coleta e mancha de lisados ​​celulares de populações clonais em duas membranas de nitrocelulose, as manchas foram testadas .......

Discussão

O sistema CRISPR / Cas9 permitiu uma geração eficiente de modificações genômicas estáveis, que proporcionam uma alternativa mais consistente a outros métodos de manipulação transitória. Aqui, apresentamos dois métodos para identificação rápida de knockouts de genes CRISPR / Cas9 em linhas celulares de mamíferos. Ambos os métodos requerem pouco material celular, pelo que o teste pode ser feito em estágios iniciais da cultura clonal, economizando tempo e reagentes. Para aumentar a eficiência de ambos os métodos, recomenda.......

Materiais

E. coli

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
preparação de plasmídeo
plasmídeo pSpCas9(BB)	Addgene	42230	Ran et al. 2013, clonagem de sgRNAs
Enzima BbsI	ThermoFisher	FD1014	Ran et al. 2013, clonagem de sgRNAs
			Ran et al. 2013, clonagem de sgRNAs
Tango Buffer	ThermoFisher	BY5	Ran et al. 2013, clonagem de sgRNAs
PlasmidSafe exonuclease	Epicentre	E3105K	Ran et al. 2013, clonagem de sgRNAs
Q5 hot start polimerase de alta fidelidade	NEB	M0494A	amplificação
de HA pUC19-BsaI			O plasmídeo pUC19 modificado, mutou o local BsaI existente e inseriu dois locais BsaI voltados para fora após a digestão de BamHI / EcoRI
pGolden-Neo	Addgene	51422	de resistência
pGolden-Hygro	Addgene	51423	de resistência
Enzima BsaI	NEB	R3535S	Construção do braço de homologia
T7 DNA ligase	NEB	M0318L
PlasmidSafe exonuclease	Epicentro	E3105K
Palitos de			PCR bacteriano
Taq polimerase			colônia bacteriana
PCR HEK293 células
DMEM	Corning	10-013-CV
FBS	Corning	MT35010CV
Penicilina-Strep (opcional.)	Placas de	15140-122
	BioLite	12556004
TransIT-LTI Reagente de Transfecção	Mirus	MIR2300	apenas para lipofecção
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062	apenas para lipofecção
G418 (Neomicina)	Sigma Aldrich	A1720-5G
Higromicina	Sigma Aldrich	H3274-250MG
Placas de 96 poços	ThermoFisher	12556008
Tampão de lise passiva, 5x	Promega
1x receita de tampão			descrita no protocolo
Membrana de nitrocelulose	Bio-Rad	162-0115
Receita de TBST			descrita no protocolo
Leite desidratado
SuperSignal West Dura Substrato de Duração Estendida	ThermoFisher	34075	para anticorpos secundários conjugados com HRP
Extrai preparação de DNA para PCR	Quantabio	95091-025
KOD polimerase	Novagen	71316

Kit de de células competente T7 DNA ligase NEB M0318L dente humanas 6 poços Gibco de carregamento SDS