Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères
Summary
Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.
Abstract
Le système d'ingénierie du génome CRISPR / Cas9 a révolutionné la biologie en permettant un montage précis du génome avec peu d'effort. Guidé par un seul ARN guide (sgRNA) qui confère une spécificité, la protéine Cas9 clive les deux brins d'ADN au locus ciblé. La rupture de l'ADN peut déclencher une jointure terminale non homologue (NHEJ) ou une réparation dirigée par homologie (HDR). NHEJ peut introduire de petites suppressions ou des insertions qui conduisent à des mutations par déplacement de trame, tandis que HDR permet des perturbations plus grandes et plus précises. Ici, nous présentons des protocoles pour générer des lignées cellulaires knock-out en couplant les méthodes CRISPR / Cas9 établies avec deux options pour la sélection / sélection en aval. L'approche NHEJ utilise un seul site de coupe de sgRNA et un dépistage indépendant de la sélection, où la production de protéines est évaluée par immunotransfert par points de manière à haut débit. L'approche HDR utilise deux sites de sgRNA coupés qui couvrent le gène d'intérêt. Ensemble avec un modèle HDR fourni, cette méthode peut éliminerDe dizaines de kb, aidé par le marqueur de résistance sélectionnable inséré. Les applications et avantages appropriés de chaque méthode sont discutés.
Introduction
Les modifications génétiques stables offrent un avantage sur les méthodes transitoires de perturbation cellulaire, qui peuvent être variables dans leur efficacité et leur durée. L'édition génomique est devenue de plus en plus courante ces dernières années en raison du développement de nucléases spécifiques cibles, telles que les nucléases 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) 6 , 7 , 8 , 9 Et des nucléases guidées par l'ARN dérivées du système de répétitions palindromiques courtes (CRISPR) regroupées, régulièrement intercalées 10 .
La machine d'édition CRISPR / Cas9 est adaptée d'un système immunitaire que les bactéries et les archées utilisent pour se défendre contre les infections viralesAss = "xref"> 11 , 12 , 13 . Dans ce processus, des fragments courts de 20-30 nt de séquence virale envahissante sont incorporés dans un locus génomique comme des "entretoises" flanqués par des unités répétitives 14 , 15 . La transcription subséquente et le traitement de l'ARN génèrent de petits ARN 16 associés à CRISPR (crRNAs) qui, conjointement avec un CRRNA 17 trans-activant (tracrRNA), assemblent avec l'endonucléase Eff9 Cas9. Les crRNAs fournissent donc une spécificité au ciblage Cas9, guidant le complexe pour cliver des séquences d'ADN virales complémentaires et prévenir d'autres infections 18 , 19 . Toute séquence "protospacer" dans l'ADN ciblé peut servir de source de l'ARNrm, pourvu qu'elle soit directement à 5 'd'un motif adjacent de protospacer court (PAM), NGG dans le cas de S. pyogenes Cas9 <sUp class = "xref"> 20. L'absence de la séquence PAM près de l'espaceur dans le locus CRISPR de l'hôte se distingue entre soi-même et non-soi, empêchant le ciblage de l'hôte. En raison de son universalité et de sa flexibilité, ce système biologique a été puissamment adapté pour l'édition génomique, de telle sorte que presque n'importe quel site d'ADN adjacente au PAM peut être ciblé. Dans cette version, une autre modification a fusionné le crRNA et l'ARNt de trac en un seul composant guide RNA (sgRNA) qui est chargé dans la protéine Cas9 21 .
Lors de l'expression de Cas9 et d'un sgRNA dans des cellules eucaryotes, la protéine Cas9 clive les deux brins d'ADN au locus ciblé. En l'absence d'une région appropriée de séquence homologue, la cellule corrige cette rupture par l'intermédiaire d'une jointure finale non homologue (NHEJ) 22 , 23 , 24 , qui introduit typiquement de petites deletions ou, rarement, des insertions. Lorsque vous ciblez unCadre de lecture, la réparation entraîne probablement un changement de cadre translationnel qui produit un produit protéique non fonctionnel. En revanche, lorsqu'elle est munie d'un modèle exogène avec de grandes régions d'homologie, la cellule peut réparer la rupture à double brin par une réparation dirigée par homologie 25 , 26 . Cette voie permet des deletions, des remplacements ou des insertions plus importantes dans le génome, associées à l'introduction de marqueurs de sélection excisables 27 .
Ici, nous présentons des protocoles pour générer des lignées cellulaires knock-out par l'une ou l'autre de ces deux méthodes CRISPR / Cas9 ( Figure 1A ). L'approche NHEJ utilise un seul site de coupe de sgRNA et un dépistage indépendant de la sélection, et nécessite donc une préparation précieuse. Lors de l'utilisation de cette méthode, il convient de concevoir des ARN de guide complémentaires aux exons près de la fin de la transcription 5 ', qui sont les plus susceptibles de produire un knock-out. Depuis le modificatLes ions du génome dans ce cas sont petits, le dépistage des clones knock-out est basé sur des transferts de points, où le produit protéique est évalué à haut débit. Nous utilisons par exemple la génération de liaisons knock-out ELAV-like 1 (ELAVL1). La deuxième approche repose sur la réparation dirigée par homologie (HDR) et utilise deux sites de sgRNA coupés qui couvrent le gène ou la région d'intérêt, ce qui permet de supprimer des dizaines de kb. Un plasmide avec deux régions d'homologie qui flanquent les sites de clivage fournit un modèle de remplacement ( Figure 1B ), en introduisant un marqueur de résistance sélectionnable qui augmente l'efficacité de la génération de knock-out. Cette méthode peut également être adaptée pour introduire des modifications de gènes avec des bras d'homologie correctement conçus. Dans ce cas, l'intégration d'un nouveau fragment d'ADN permet un dépistage par PCR ( Figure 1C ). Ici, nous utilisons la génération des lignes knock-out 2 de la famille de liaison Pumilio RNA (PUM2) à titre d'exemple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système CRISPR / Cas9 a permis une génération efficace de modifications génomiques stables, qui fournissent une alternative plus cohérente aux autres méthodes de manipulation transitoires. Ici, nous avons présenté deux méthodes pour l'identification rapide des knockouts du gène CRISPR / Cas9 dans les lignées cellulaires de mammifères. Les deux méthodes nécessitent peu de matériel cellulaire, de sorte que les tests peuvent être effectués dans les premiers stades de la culture clonale, en économis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Gissell Sanchez, Megan Lee et Jason Estep pour l'aide expérimentale, et Weifeng Gu et Xuemei Chen pour le partage des réactifs.
Materials
| Competent E. coli cells | |||
| plasmid prep kit | |||
| pSpCas9(BB) plasmid | Addgene | 42230 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| BbsI enzyme | ThermoFisher | FD1014 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Tango Buffer | ThermoFisher | BY5 | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | Ran et al 2013, cloning sgRNAs |
| Q5 hot start high fidelity polymerase | NEB | M0494A | HA amplification |
| pUC19-BsaI | Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion | ||
| pGolden-Neo | Addgene | 51422 | Resistance cassette |
| pGolden-Hygro | Addgene | 51423 | Resistance cassette |
| BsaI enzyme | NEB | R3535S | Homology arm contruction |
| T7 DNA ligase | NEB | M0318L | |
| PlasmidSafe exonuclease | Epicentre | E3105K | |
| Toothpicks | bacterial PCR | ||
| Taq polymerase | bacterial colony PCR | ||
| HEK293 human cells | |||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Corning | MT35010CV | |
| Penicillin-Strep (opt.) | Gibco | 15140-122 | |
| 6 well plates | BioLite | 12556004 | |
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2300 | for lipofection only |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | for lipofection only |
| G418 (Neomycin) | Sigma Aldrich | A1720-5G | |
| Hygromycin | Sigma Aldrich | H3274-250MG | |
| 96 well plates | ThermoFisher | 12556008 | |
| Passive Lysis Buffer, 5x | Promega | ||
| 1xSDS loading buffer | recipe decribed in protocol | ||
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| TBST | recipe decribed in protocol | ||
| Dehydrated milk | |||
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | for HRP-conjugated secondary antibodies |
| Extracta DNA prep for PCR | Quantabio | 95091-025 | |
| KOD polymerase | Novagen | 71316 |
Referências
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genética. 188 (4), 773-782 (2011).
- Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
- Bibikova, M., et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genética. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).
- Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genética. 186 (2), 757-761 (2010).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Karginov, F. V., Hannon, G. J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea. Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).
- Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Guirouilh-Barbat, J., et al. Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells. Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).
- Moore, J. K., Haber, J. E. Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).
- Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genética. 196 (4), 961-971 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning. Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
