É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

10.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/55908

⸱

12 de junho de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Institute of Translational Pharmacology, Italian National Research Council, 2Epigenetics and Regenerative Medicine, IRCCS Fondazione Santa Lucia, 3Biological and Environmental Sciences and Engineering Division, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 4Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

Neste artigo

Resumo

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Resumo

O aumento da evidência aponta para a autofagia como um processo regulatório crucial para preservar a homeostase do tecido. Sabe-se que a autofagia está envolvida no desenvolvimento e regeneração do músculo esquelético, e o processo autofágico foi descrito em várias patologias musculares e distúrbios musculares relacionados à idade. Um bloco recentemente descrito do processo autofágico que se correlaciona com o esgotamento funcional das células satélites durante o reparo muscular reúne a noção de que a autofagia ativa é acoplada à regeneração muscular produtiva. Estes dados revelam o papel crucial da autofagia na ativação das células satélites durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas, como distrofias musculares. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico no compartimento adulto da célula tronco muscular (MuSC) durante as condições regenerativas musculares. Este protocolo descreve a metodologia de instalação para realizar a imunofluorescência in situ de LC3, umaMarcador de utofagy e MyoD, um marcador de linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o compartimento MuSC, que desempenha um papel central na orquestação da regeneração muscular.

Introdução

A regeneração muscular esquelética é o resultado da interação entre células estaminais adultas (células musculares de músculo, MuSCs) e outros tipos de células envolvidas no processo regenerativo. A homeostase muscular e a funcionalidade são mantidas pelos sinais combinados decorrentes do nicho muscular e das indicações sistêmicas 1 , 2 . Ao longo da vida, foram relatadas mudanças na funcionalidade MuSC, no nicho muscular e nas pistas sistêmicas, levando ao declínio das capacidades funcionais nos idosos 3 . Os MuSCs são definidos em um nicho abaixo da lâmina basal e, após lesão muscular, são ativados para reparar os músculos danificados 4 , 5 . Para garantir uma resposta regenerativa produtiva, é crucial que os MuSCs coordenem os diferentes processos necessários para a saída da quiescência, a auto-renovação e o estágio de expansão proliferativa seguiramPela diferenciação miogênica 6 . Nos idosos e nas doenças crônicas musculares, todas essas funções são comprometidas, levando a funcionalidades musculares alteradas 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 .

A macroautofagia (referida a seguir como autofagia) está emergindo como um processo biológico crucial essencial para preservar a homeostase dos tecidos 14 . O processo autofágico inclui mecanismos de tráfico, em que partes de citoplasma, organelas e proteínas são engrossadas em vesículas que eventualmente são degradadas através da via do lisossoma, promovendo a remoção de moléculas tóxicas e a reciclagem de macromoleCules. Isso fornece compostos ricos em energia para apoiar a adaptação das células e tecidos sob estresse ou outras condições adversas 15 , 16 . Juntamente com a sua atividade de sobrevivência celular, a autofagia também pode funcionar como indutor de morte celular, dependendo do contexto do tecido celular ( por exemplo, tecido normal versus câncer) e do tipo de estímulo de estresse 17 , 18 .

Evidências recentes indicam que a autofagia é necessária para manter a massa muscular e a integridade da miofibra 19 , 20 e foi relatada como prejudicada em diferentes distrofias musculares 21 , 22 , 23 , incluindo a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Da mesma forma, uma redução progressiva do processo autofágico foi observada nos idosos 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , após perda de massa muscular (referida como sarcopenia) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e na sobrevivência de miofibra 38 .

Uma relação estreita entre a autofagia e o potencial regenerativo dos músculos esqueléticos foi antecipada por um estudo do laboratório de Wagers, que mostrou que uma restrição calórica aumenta a disponibilidade e a atividade de MuSC 39 . Isso nãoFoi ainda apoiada pela recente observação de que o eixo Foxo3-Notch ativa o processo autofágico durante a auto-renovação 40 e a transição MuSC do estado quiescente para o estado proliferativo 41 . Esses dados concordam com a redução progressiva da autofagia basal de MuSCs jovens e antigos e geriátricos, em associação com o declínio numérico e funcional de MuSCs durante o envelhecimento 42 .

Em um artigo recente, demonstramos uma estreita relação entre a autofagia e a regeneração muscular compensatória que distingue os estágios iniciais da progressão da DMD. Consequentemente, observamos um fluxo autofágico reduzido nos estágios posteriores da progressão da doença, quando a regeneração muscular é comprometida e a deposição de tecido fibrótico ocorre. Intrigantemente, mostramos que, em condições de regeneração, a autofagia é ativada nos MuSCs e que a modulação do processo autofágico afeta a ativação MuSC e o fuNação universal 30 .

No total, esses dados destacam a urgência de explorar o processo autofágico em MuSCs durante a regeneração muscular em condições normais e patológicas e ao longo da vida. Aqui, fornecemos um protocolo para monitorar o processo autofágico em MuSCs nas condições regenerativas musculares, realizando imunocoloração in situ para proteína 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada a microtúbulos, um marcador de autofagia 43 e MyoD, um marcador de Linhagem miogênica, em seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos. A metodologia relatada permite monitorar o processo autofágico em um compartimento celular específico, o MuSC, que desempenha um papel fundamental na orquesta da regeneração muscular.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Os ratos foram criados e mantidos de acordo com os procedimentos padrão das instalações de animais, e todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Garantia de Assistência Animal e pelo Comitê Ético de Pesquisa em Animais interno de acordo com o Ministério da Saúde italiano e cumprido o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório.

1. Lesão muscular e o bloco In-Vivo de Fluxo Autofágico

  1. Lesão muscular.
    1. Para induzir uma lesão aguda do músculo esquelético, injete 20 μL de cardiotoxina 10 μM (CTX) diretamente no músculo tibial anterior anterior (TA) de ratos C57BL / 6J de 2 meses que pesam aproximadamente 20 g. Use um número igual de machos e fêmeas. Use o membro contralateral imperturbável como controle.
      NOTA: 10 μM de CTX em solução de cloreto de sódio a 0,9% devem ser filtrados (filtro PVDF de 0,22 μm) e armazenados a -20 ° C. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
    2. Usando um euSeringa nsulin com uma agulha de 30 G, injetar CTX no meio do TA. Para induzir uma lesão precisa no AT, assegure-se de que a agulha da seringa entre perto do tendão distal, com 5 mm de profundidade, do fundo para o topo do músculo ( Figura 1A ).
  2. Bloqueio do fluxo autofágico em ratos não perturbados e feridos.
    1. Para avaliar o fluxo autofágico, 24 h Post-Injury (pi), administre 50 mg / kg de cloroquina (CLQ) a cada 24 h durante 4 dias por injeção intraperitoneal (IP) ( Figura 1B ).
      1. Dissolve CLQ (10 mg / mL) em PBS 1X e filtre-a através de uma membrana de 0,2 μm. Pesar todos os ratos e calcular a quantidade de CLQ para injetar.
        NOTA: Prepare e use a solução CLQ no mesmo dia. O estoque CLQ pode ser armazenado por até um mês a -20 ° C. Uma vez que a autofagia é um processo relacionado ao metabolismo, sempre execute o tratamento CLQ sempre ao mesmo tempo (por exemplo, na manhã seguinteRe 10 AM).

2. Seções de tecido muscular

  1. Sacrifício do rato.
    1. Eutanizar os ratos 5 dias após a lesão.
    2. Realize a eutanásia por luxação cervical ou por CO 2 (a seguir pela luxação cervical para confirmação). Uma vez que o processo de autofagia está relacionado aos hábitos de sono / alimentação do mouse, sempre sacrificar os ratos ao mesmo tempo, de preferência pela manhã ( ou seja, antes das 10:00 da manhã).
  2. Isolamento e inclusão de TA.
    1. Antes da dissecção, pulverize o mouse com etanol a 70%.
    2. O uso de tesoura faz uma pequena e perpendicular incisão (3 mm de comprimento) na pele dorsal do mouse ao nível dos quadris. Corte a cauda e os pés para simplificar a remoção da pele. Puxe a pele para a cauda e remova-a para expor os músculos subjacentes; O músculo TA é fácil de localizar, como mostrado na Figura 2A .
    3. Com a ajuda de duas fórceps, aperte os tendões distal.
    4. Corte os tendões distal; Os tendões TA e extensor digitorium longus (EDL) são frequentemente cortados em conjunto e posteriormente separados (ver passo 2.2.6).
    5. Usando fórceps, segure o músculo TA pelo tendão e puxe cuidadosamente o músculo para a extremidade proximal (perto do joelho, Figura 2B ).
      NOTA: Neste ponto, os músculos EDL e TA são facilmente reconhecíveis, sendo o TA maior e mais superficial do que o EDL.
    6. Separe o TA do músculo EDL puxando os dois tendões distal nas direções opostas ( Figura 2C ).
    7. Corte o tendão proximal.
    8. Usando fórceps, remova a fáscia fina que cobre o músculo, sem danificar o tecido.
    9. Remova a umidade excessiva na amostra com a ajuda de uma toalha de papel. Certifique-se de que o músculo não esteja nem molhado, nem excessivamente seco, pois a umidade excessiva produzirá sigDano significativo ao músculo e compromete a próxima coloração.
    10. Coloque o composto Optimal Cutting Temperature (OCT) na parte inferior de um molde e coloque o músculo dentro dele, na orientação mostrada na Figura 2D . Adicione 100% de isopentano a um copo até atingir uma profundidade de aproximadamente 3-4 cm. Coloque o copo em contato com nitrogênio líquido em uma caixa de poliestireno.
    11. Não deixe o nitrogênio líquido entrar no copo, pois produzirá uma espuma borbulhante, o que pode afetar a inclusão e danificar as seções musculares.
    12. Observe o isopentano e aguarde até atingir a temperatura adequada (entre -140 ° C e -150 ° C); À temperatura apropriada, uma camada branca sólida de isopentano congelado cristaliza no fundo do copo.
    13. Se o isopentano congelar completamente o sólido, derreta-o e esfrie até a temperatura de congelação antes de prosseguir para o próximo passo.
    14. Usando fórceps pré-grelhados, delicadamente abaixe o molde emO isopentano por aproximadamente 20-30 s. Coloque a amostra congelada em um recipiente com gelo seco até que seja transferida para um congelador de -80 ° C.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
  3. Criosecções de tecido muscular.
    1. Após pelo menos uma noite a -80 ° C, execute a criosecção.
    2. Pegue a faca criostática e a placa anti-rolo do congelador de -20 ° C e coloque-os nos respectivos suportes no gabinete do criostato.
    3. Coloque uma gota de OCT no talão da amostra e coloque sobre ela a amostra congelada, na orientação vertical NS, conforme visualizado na Figura 2D .
    4. Coloque o talão de amostra no mandril.
    5. Sem puxar o prato anti-rolo na faca, faça alguns cortes a 40 μm para se livrar de OCT que não inclui músculo. Quando o músculo se torna visível, reduza a espessura da fatia para 7-8 μm.
    6. Puxe para baixo a placa anti-roll até ficar alinhada comA ponta da faca ou um pouco acima dela.
    7. Corte as secções transversais de 7-8 μm de espessura e monte 3-4 fatias por lâmina histológica.
      NOTA: A temperatura sugerida do criostato está entre -15 ° C e -23 ° C. As secções transversais das amostras são necessárias para a análise subsequente para identificar as células-tronco muscular na posição de nicho do satélite.
    8. Para maximizar a aderência da seção, mantenha as lâminas à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para evitar o seu desprendimento durante a incubação do anticorpo.
      NOTA: O passo de secagem ao ar pode afetar a imunocoloração, proporcionando resultados ambíguos. Os slides podem ser armazenados sem fixação por vários meses a -80 ° C. O protocolo pode ser pausado aqui.
  4. Verificando danos musculares em criosecções de músculos TA ao realizar a coloração com hematoxilina eosina (H & E).
    1. Para avaliar a qualidade do músculo ( ou seja, a eficácia da lesão, isolamento muscular e inclusãoÍons e criosecções), realizam uma coloração H & E. Para cada ponto de tempo experimental, conserte um slide com 4% de PFA por 10 min. Após a fixação, lave bem as corrediças em várias mudanças de 1x PBS.
      NOTA: Cuidado. O PFA é cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado.
    2. Pegue um slide para cada ponto experimental e coloque-os em uma jarra de coloração.
    3. Encha o frasco com hematoxilina 9 g / L até as secções serem cobertas e incubar durante 8 min.
    4. Recicle a hematoxilina.
    5. Deixe o frasco sob água corrente durante 10 minutos para remover o excesso de hematoxilina.
      NOTA: Certifique-se de não fluir a água diretamente para as seções.
    6. Lavar com água esterilizada.
    7. Incubar as secções com eosina 0,5% (p / v) em etanol a 90% acidificado durante 1 min.
    8. Recicle a eosina.
    9. Lave duas vezes com água estéril por 3 minutos / lavagem.
      NOTA: Execute as seguintes etapas em um capô químico.
    10. Lave as secções com etanol a 70%.
    11. lavarAs seções com 90% de etanol.
    12. Lave as secções com 100% de etanol.
    13. Incube as secções com 0,879 g / mL de o-Xileno.
      NOTA: Cuidado. O-Xileno é inflamável e moderadamente tóxico. Manipule-o sob uma capa química, usando equipamento de proteção, incluindo luvas, um bata de laboratório e uma máscara.
    14. Recicle o o-Xileno.
    15. Coloque as lâminas sobre um pedaço de papel para secar.
    16. Feche os slides usando um meio de montagem com base em xileno rápido.
    17. Verifique a qualidade das seções sob um microscópio óptico com ampliação de 10X (veja a Figura 3 )
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. Imunomarcação para LC3 e MyoD em seções de tecido muscular ferido

  1. Fixação de seções de tecido muscular.
    1. Prepare uma câmara de incubação molhando um pedaço de papel e colocando-o no fundo de uma caixa de plástico fechável para manter um altoVelocidade de umidade dentro da câmara. Corrigir seções de tecido com 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS durante 10 min.
      NOTA: Um pedaço de papel molhado é usado para evitar a secagem da amostra. Prepare PFA fresco ou use PFA armazenado a -20 ° C. Cuidado. PFA é tóxico; O pó deve ser manuseado com cuidado ao fazer a solução de estoque. Esta operação deve ser realizada em um capô químico, com equipamento de proteção, incluindo luvas, um bata de laboratório e uma máscara. Além disso, quando em solução, o PFA deve ser manipulado com cuidado.
    2. Remova o PFA e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3 vezes.
  2. Permeabilização de seções de tecido muscular.
    1. Desenhe uma barreira hidrofóbica em torno das seções de tecido usando uma caneta pap.
      NOTA: Este passo define a superfície ao redor das seções de tecido e minimiza o volume de anticorpos descritos nas etapas 3.4, 3.6, 3.7 e 3.9.
    2. Cubra as secções com 200 μL de frio (-20 ° C)Metanol e coloque a câmara de incubação horizontalmente dentro de um congelador a -20 ° C durante 5 min.
    3. Retire a câmara de incubação do congelador, aspirar o metanol e lave as secções com 1X PBS durante 5-7 minutos à TA; Repita este passo 3x.
  3. Bloqueio
    1. Prepare uma solução de bloco fresco de 4% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS 1x.
      NOTA: A solução BSA pode ser armazenada durante 1 semana a 4 ° C.
    2. Incube as secções com solução de bloqueio durante pelo menos 60 minutos à RT.
    3. Remova a solução de bloqueio.
    4. Prepare 100 μL de mistura anti-Fab diluyendo 20 μg / mL anti-Fab em 1x PBS. Incubar as secções com um fragmento F (ab) purificado por afinidade não conjugado de IgG anti-ratinho durante 1 h à TA.
  4. Incubação primária de anticorpos.
    1. Prepare 100 μL de mistura primária de anticorpos para cada lâmina, dissolvendo os anticorpos LC3 e MyoD em 4% de BSA em 1x PBS. Use 5 μg /ML de anti-LC3 (anticorpo policlonal de coelho) e 10 mg / L de anti-MyoD (anticorpo monoclonal de rato). Incubar a mistura primária de anticorpos durante a noite a 4 ° C.
  5. Lavagens.
    1. Remova a mistura primária de anticorpos.
    2. Lavar as secções com 1% de BSA em 1X PBS durante 10 min; Repita este passo 3x.
  6. Incubação secundária de anticorpos.
    1. Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina. Dissolver 488 de cabra anti-coelho (5 μg / mL) e 594 de cabra anti-ratinho (5 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS.
      NOTA: Evite a exposição excessiva à luz para evitar o branqueamento com fluorochrome. Execute as seguintes etapas no escuro.
    2. Incubar as secções com a mistura de anticorpos secundário durante 45 minutos à TA.
    3. Remova a mistura de anticorpos secundários e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x.
  7. Incubação primária de anticorpos.
    1. Diluir laminiAnticorpo monoclonal n-2 (cadeia α-2) (0,33 μg / mL) em BSA a 4% em 1x PBS usando 100 μL de mistura para cada slide. Incubar as secções na mistura de anticorpos primários durante 1-2 h à TA.
  8. Lavagens.
    1. Remova a mistura primária de anticorpos.
    2. Lavar as secções com 1% de BSA em 1X PBS durante 10 min; Repita este passo 3x.
  9. Incubação secundária de anticorpos.
    1. Prepare 100 μL de mistura de anticorpos secundários para cada lâmina diluyendo 647 de cabra anti-rato (5 μg / mL) em BSA a 4% em PBS 1X. Incubar as secções na mistura de anticorpos secundários durante 45 minutos à TA.
    2. Remova a mistura de anticorpos secundários e lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x.
  10. 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindole (DAPI).
    1. Adicione 200 μL de solução de DAPI 300 nM em 1x PBS a cada slide. Incubar durante 5 min à TA. Armazene a solução DAPI a 4 ° C noSombrio.
    2. Lave as secções com 1x PBS durante 5-7 min; Repita este passo 3x.
  11. Montagem de seções musculares coradas.
    1. Remova o excesso de solução de lavagem das seções.
    2. Coloque 10 μL de glicerol em 1x PBS (3: 1) nas secções coradas no meio do slide e adicione um lamínula, evitando a formação de bolhas de ar.

4. Aquisição de microscopia confocal

  1. Adquira as imagens usando um microscópio confocal de quatro laser integrado com um sistema de captura de imagem e software analítico.
    NOTA: MyoD é conjugado com um corante 594 que é um corante fluorescente vermelho brilhante, com excitação ideal para o laser de 594 nm (excitação: 590 nm, emissão: 617 nm). LC3 é conjugado com um corante 488 que é um corante fluorescente verde brilhante, com excitação ideal para a linha laser de 488 nm (excitação: 495 nm, emissão: 519 nm). Laminin é conjugado com um corante 647 que éUm corante brilhante fluorescente far-vermelho, com excitação ideal para a linha a laser de 647 nm (excitação: 650 nm, emissão: 668 nm).
  2. Coloque os slides na bandeja do microscópio e use a ampliação 63X para detectar sinais nucleares. Concentre-se manualmente nas áreas regenerativas centrando os campos de regeneração ativa, confiando na morfologia muscular (veja a Figura 4 ).
    NOTA: Enquanto o músculo não perturbado, o tamanho da miofibra é praticamente constante ( Figura 4A ), a regeneração muscular mediada por lesões pode ser reconhecida pela aparência de miofibras menores, que são as fibras recém formadas após a regeneração. Além disso, o músculo na regeneração ativa é caracterizado por um extenso infiltrado que é feito de macrófagos, precursores fibro-adipogênicos e células que estão localizados nos músculos danificados para orquestrar a regeneração muscular ( Figura 4B ).
  3. Avaliar a coloração imunofluorescente em regenOcupando áreas focadas em MuSCs que estão localizados sob a lâmina basal das miofibras.
  4. Concentre-se em MuSCs que são positivos para a coloração MyoD e posicionados dentro das miofibras marcadas pela coloração de laminina (ver Figura 4B , setas brancas).
  5. Use pelo menos 3 ratos / grupo experimental e use o microscópio para adquirir imagens de ampliação 63X de pelo menos 7 campos para cada grupo experimental.
  6. Uma vez identificadas as áreas regenerativas, concentre-se na coloração DAPI e, em seguida, ajuste os outros canais individuais.
    1. Use as seguintes configurações de microscópio: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Canal A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Canal A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719.
  7. Depois de ajustar o foco dos canais individuais, proceda a adquirir as imagens com um tamanho de quadro de 1.024 x 1.024 e uma ocupação de pixels de 12,61 μs.
  8. Contagem da porcentagem de células MyoD-positivas (controle para tEle correta localização sob a lâmina) que são LC3-negativos e a porcentagem de células MyoD-positivas que exibem um sinal LC3.
    NOTA: A porcentagem de células positivas para MyoD que exibem coloração LC3 é a leitura deste protocolo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Este protocolo descreve um método in situ eficiente para detectar autofagia em MuSCs durante a regeneração muscular.

Tratamentos CTX In Vivo :

Use CTX para induzir danos musculares nos músculos TA e use músculos não perturbados como controles. Uma vez que a autofagia é altamente dinâmica, bloqueie o fluxo autofágico realizando injeções IP de CLQ (

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este protocolo descreve como monitorar a autofagia nas células-tronco do músculo esquelético durante a regeneração muscular compensatória. Vários anticorpos para co-coloração de LC3 e MyoD foram testados, e aqueles que trabalham em seções de tecido de mouse e criam resultados bem-sucedidos estão listados aqui (ver Tabela de Materiais ). A permeabilização com metanol (ver passo 3.2.2) é altamente recomendável para coloração bem sucedida.

A limitação deste protocolo está...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIAMS AR064873, Epigen Project PB. P01.001.019 / Progetto Bandiera Epigenomica IFT para LL

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C57BL/6JThe Jackson Laboratory000664camundongos WT
Cardiotoxina 1LatoxanL8102
Millex-VVMerck MilliporeSLVV033RSSeringa Unidade de Filtro, 0.1 µ m, PVDF, 33 mm,
sal de difosfato de cloroquinaSigma-AldrichC6628Cuidado:
Nocivo se ingerido
BD Micro-Fine + 0,5 mLBD324825
Tissue-Tek O.C.T. compostoSakura Finetek25608-930
Tissue-Tek Cryomold IntermediateSakura Finetek4566
2-MetilbutanoSolução de
eosina Y Sigma-AldrichHHS32por Harris
HT110132alcoólicaSigma-Aldrich
o-xilenoSigma-AldrichX1040Cuidado:
Líquido e vapor inflamáveis; Pode ser fatal se ingerido e entrar nas vias aéreas; Nocivo em contacto com a pele; Pode causar irritação respiratória; Causa irritação ocular grave
Paraformaldeído (PFA)Sigma-AldrichP6148Cuidado:
Sólido inflamável; Nocivo por ingestão; Causa irritação na pele; Pode causar uma reação alérgica na pele; Causa sérios danos aos olhos; Pode causar irritação respiratória; Suspeito de causar câncer
DPBS, sem cálcio, sem magnésioThermo Fisher Scientific14190-094
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA7030
GlicerolSigma-AldrichG5516
Eukitt - Meio de montagem de endurecimento rápidoSigma-Aldrich3989
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-007-003
LC3B Anticorpode sinalização celular2775
Clone monoclonal de camundongo anti-MyoD
(concentrado) 5.8A		DAKO - Agilent Pathology SolutionsM3512
Laminin-2 (α-2-chain) anticorpo monoclonalEnzo Life Sciences4H8-2
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Life technologiesA11005
Alexa Fluor Goat Anti-Rat IgM AntibodyLife technologiesA21248
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)Thermo Fisher ScientificD1306
esterilizado por gama hematoxilina 277258 Sigma-Aldrich, solução de modificada, Tecnologia

Referências

  1. Bentzinger, C. F., et al. Differential response of skeletal muscles to mTORC1 signaling during atrophy and hypertrophy. Skelet Muscle. 3 (1), (2013).
  2. Chakkalakal, J. V., et al. The aged niche disrupts muscle stem cell quiescence. Nature. 490 (7420), 355-360 (2012).
  3. Jang, Y. C., et al. Skeletal muscle stem cells: effects of aging and metabolism on muscle regenerative function. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 101-111 (2011).
  4. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
  5. Collins, C. A., Partridge, T. A. Self-renewal of the adult skeletal muscle satellite cell. Cell Cycle. 4 (10), 1338-1341 (2005).
  6. Bentzinger, C. F., et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
  7. Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in skeletal muscle of aged mice. Nat Med. 20 (3), 265-271 (2014).
  8. Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nat Med. 20 (3), 255-264 (2014).
  9. Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
  10. Madaro, L., Latella, L. Forever young: rejuvenating muscle satellite cells. Front Aging Neurosci. 7, 37(2015).
  11. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  12. Tierney, M. T., et al. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair. Nat Med. 20 (10), 1182-1186 (2014).
  13. Judson, R. N., Zhang, R. H., Rossi, F. M. Tissue-resident mesenchymal stem/progenitor cells in skeletal muscle: collaborators or saboteurs? FEBS J. 280 (17), 4100-4108 (2013).
  14. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40 (2), 280-293 (2010).
  15. Marino, G., Madeo, F., Kroemer, G. Autophagy for tissue homeostasis and neuroprotection. Curr Opin Cell Biol. 23 (2), 198-206 (2011).
  16. Jiang, P., Mizushima, N. Autophagy and human diseases. Cell Res. 24 (1), 69-79 (2014).
  17. Eskelinen, E. L. Doctor Jekyll and Mister Hyde: autophagy can promote both cell survival and cell death. Cell Death Differ. 12, Suppl 2. 1468-1472 (2005).
  18. Basile, V., et al. bis-Dehydroxy-Curcumin triggers mitochondrial-associated cell death in human colon cancer cells through ER-stress induced autophagy. PLoS One. 8 (1), e53664(2013).
  19. Neel, B. A., Lin, Y., Pessin, J. E. Skeletal muscle autophagy: a new metabolic regulator. Trends Endocrinol Metab. 24 (12), 635-643 (2013).
  20. Sandri, M. Autophagy in skeletal muscle. FEBS Lett. 584 (7), 1411-1416 (2010).
  21. Grumati, P., et al. Autophagy is defective in collagen VI muscular dystrophies, and its reactivation rescues myofiber degeneration. Nat Med. 16 (11), 1313-1320 (2010).
  22. Chrisam, M., et al. Reactivation of autophagy by spermidine ameliorates the myopathic defects of collagen VI-null mice. Autophagy. 11 (12), 2142-2152 (2015).
  23. Grumati, P., et al. Autophagy induction rescues muscular dystrophy. Autophagy. 7 (4), 426-428 (2011).
  24. De Palma, C., et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 3, e418(2012).
  25. Hindi, S. M., et al. Distinct roles of TRAF6 at early and late stages of muscle pathology in the mdx model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (6), 1492-1505 (2014).
  26. Pauly, M., et al. AMPK activation stimulates autophagy and ameliorates muscular dystrophy in the mdx mouse diaphragm. Am J Pathol. 181 (2), 583-592 (2012).
  27. Spitali, P., et al. Autophagy is Impaired in the Tibialis Anterior of Dystrophin Null Mice. PLoS Curr. 5, (2013).
  28. Whitehead, N. P. Enhanced autophagy as a potential mechanism for the improved physiological function by simvastatin in muscular dystrophy. Autophagy. 12 (4), 705-706 (2016).
  29. Whitehead, N. P., et al. A new therapeutic effect of simvastatin revealed by functional improvement in muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (41), 12864-12869 (2015).
  30. Fiacco, E., et al. Autophagy regulates satellite cell ability to regenerate normal and dystrophic muscles. Cell Death Differ. 23 (11), 1839-1849 (2016).
  31. Lee, I. H., et al. A role for the NAD-dependent deacetylase Sirt1 in the regulation of autophagy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3374-3379 (2008).
  32. Rubinsztein, D. C., Mariño, G., Kroemer, G. Autophagy and aging. Cell. 146 (5), 682-695 (2011).
  33. Colman, R. J., et al. Caloric restriction delays disease onset and mortality in rhesus monkeys. Science. 325 (5937), 201-204 (2009).
  34. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132 (1), 27-42 (2008).
  35. Yang, L., et al. Long-Term Calorie Restriction Enhances Cellular Quality-Control Processes in Human Skeletal Muscle. Cell Rep. 14 (3), 422-428 (2016).
  36. Wenz, T., et al. Increased muscle PGC-1alpha expression protects from sarcopenia and metabolic disease during aging. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20405-20410 (2009).
  37. Carnio, S., et al. Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. Cell Rep. , (2014).
  38. Sandri, M., et al. Misregulation of autophagy and protein degradation systems in myopathies and muscular dystrophies. J Cell Sci. 126 (Pt 23), 5325-5333 (2013).
  39. Cerletti, M., et al. Short-term calorie restriction enhances skeletal muscle stem cell function. Cell Stem Cell. 10 (5), 515-519 (2012).
  40. Gopinath, S. D., et al. FOXO3 promotes quiescence in adult muscle stem cells during the process of self-renewal. Stem Cell Reports. 2 (4), 414-426 (2014).
  41. Tang, A. H., Rando, T. A. Induction of autophagy supports the bioenergetic demands of quiescent muscle stem cell activation. EMBO J. 33 (23), 2782-2797 (2014).
  42. Garcia-Prat, L., et al. Autophagy maintains stemness by preventing senescence. Nature. 529 (7584), 37-42 (2016).
  43. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Monitoramento da AutofagiaDetecção de LC3Coloração de MyoDMicroscopia ConfocalSeccionamento de TecidosTratamento com CloroquinaAnálise de Células SatélitesRegeneração Muscular
Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.