Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling
Summary
Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.
Abstract
De mechanismen tot regeling van mRNA vertaling zijn betrokken in verschillende biologische processen, zoals kiem lijn ontwikkeling, celdifferentiatie en organogenese, evenals in meerdere ziekten. Talrijke publicaties hebben overtuigend aangetoond dat de specifieke mechanismen strak mRNA vertaling regelen. Toegenomen belangstelling voor de vertaling-geïnduceerde regulering van eiwit expressie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe methoden om te bestuderen en volgen DOVO eiwit synthese in gnudles. Meeste van deze methoden zijn echter complex, waardoor ze duur en vaak een beperkt aantal mRNA doelen die kunnen worden bestudeerd. Dit manuscript wordt voorgesteld een methode waarvoor alleen eenvoudige reagentia en een confocal fluorescentie imaging systeem om te meten en visualiseren van de veranderingen in vertaling van mRNA die op een willekeurige cellijn onder verschillende omstandigheden optreden. Deze methode werd onlangs gebruikt om te laten zien van gelokaliseerde vertaling in de subcellular structuren van Adherente cellen over een korte periode van tijd, waardoor de mogelijkheid van het visualiseren van DOVO vertaling voor een korte periode tijdens een verscheidenheid van biologische processen of wijzigingen in translationeel activiteit in reactie op specifieke stimuli te valideren.
Introduction
De regulering van de vertaling door verschillende cellulaire functies heeft ertoe geleid dat vele onderzoeksteams te ontwikkelen van nieuwe instrumenten en methoden voor de bepaling van de subcellular localisatie van mRNA vertaling en gereglementeerde eiwit synthese1,2 ,3,4. Deze recente technologische vooruitgang zorgen voor een beter begrip van de mechanismen met betrekking tot vertaling opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs tijdens biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase5 ,6,7,8. Echter, de meeste van deze methoden vereist duur of gevaarlijke reagentia en specifieke apparatuur die mogelijk niet beschikbaar voor de meeste laboratoria. Als zodanig, werd een voordelige methode te voorzien in de snelle evaluatie van vertaling gebeurtenissen ontwikkeld om deze potentiële problemen specifiek te omzeilen. Deze methode detecteert acute translationeel modulaties die zich tijdens specifieke cellulaire processen voordoen en voorziet ook in de lokalisatie van de vertaling met behulp van de confocal microscopie.
De hier beschreven methoden werden gebruikt om te controleren van gelokaliseerde vertaling binnen subcellular compartimenten genaamd verspreiden initiatie centra (SIC)5. SICs zijn tijdelijke structuren gevonden in geplaatste cellen, die zijn gelokaliseerd op de top van ontluikende hechting complexen. Hoewel SICs en hechting complexen onderscheiden worden, zijn hun lot nauw verbonden. Inderdaad, SICs is bekend dat het geleidelijk aan verdwijnen op focal hechting complexe rijping in een hechting site tijdens de eerste fase van de hechting. We vonden dat RNA-bindende proteïnen bekend om specifiek mRNA vertaling (b.v., Sam68, FMRP en G3BP1) en polyadenylated RNAs werden verrijkt binnen deze structuren5. Met behulp van de methoden beschreven hier toonden wij dat de regulering van SIC-geassocieerde mRNA vertaling als een controlepunt waardoor fungeert zaadjes cellen wilt samenvoegen cel adhesie. Deze methode, op basis van puromycin de opneming, kan worden overwogen een aangepaste versie van de oppervlakte sensing van vertaling assay (zonsondergang). Oorspronkelijk ontwikkeld voor het meten van globale eiwit synthese tarieven met behulp van een niet-radioactief gelabelde aminozuur, biedt eiwit puromycilation een efficiënte manier te visualiseren van DOVO eiwit synthese9. Deze methode is gebaseerd op de intrinsieke werking van puromycin, een antibioticum dat vertaling door voortijdige keten beëindiging in de ribosome10 blokkeert. Inderdaad, puromycin is structureel analoog aan tyrosyl-tRNA, die voorziet in de opneming in het grondvlak van de peptide ketens via de vorming van een peptide-bond. Puromycin binding aan een groeiende peptide keten voorkomt echter dat een nieuwe peptide bond ontstaat met de volgende aminoacyl-tRNA, aangezien puromycin een niet-hydrolyseerbaar amide-binding in plaats van de hydrolyseerbaar ester-binding in tRNAs gevonden heeft. Dus, de opneming van puromycin in het grondvlak polypeptiden resulteert in de voortijdige vrijlating van talrijke afgeknotte puromycilated polypeptiden overeenkomt met actief vertaalde mRNA9,11,12 .
Met behulp van deze methode, was het mogelijk om binnen een korte tijd weduwe actieve vertaling beoordelen (bijvoorbeeld 5 min) tijdens de cellulaire hechting met behulp van een specifiek antilichaam gericht tegen puromycin op cellen die werden aangevuld met het antibioticum voor periodes van 5-min verwerken op verschillende tijdstippen tijdens de cel adhesie5. De nauwkeurigheid van deze test is gebaseerd op zeer specifieke antilichamen gericht tegen de groep van de puromycilated. Immunefluorescentie detectie van de puromycilated-polypeptide biedt een algemene subcellular verdeling van de nieuwe vertaalde mRNA, die ook kan worden gekwantificeerd met grote nauwkeurigheid met behulp van de confocal imaging systemen.
Vandaar, deze methode biedt tevens een relevante optie voor een groot aantal laboratoria studeren translationeel regulerende mechanismen betrokken bij processen zoals neuronale granulatie6,13,14, 15, morphogen mRNA lokalisatie en vertaling tijdens ontwikkeling16,17. Het is ook zeer geschikt voor het bestuderen van gelokaliseerde of verzuilde vertaling tijdens snelle biologische gebeurtenissen, zoals cel migratie, hechting, of invasie, of gewoon beoordelen drug behandelingen die vertalende wijzigingen5, induceren kunnen 7 , 18. over het algemeen met deze methode kan voor de visualisatie van gelokaliseerde of gecontroleerde vertaling gebeurtenissen in een snelle, nauwkeurige en kosteneffectieve manier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recente technologische vooruitgang hebben toegestaan voor een beter begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij translationeel opregulatie of de onderdrukking van specifieke mRNAs in biologische processen, zoals de neuronale ontwikkeling, drug reactie en metastase. De hier beschreven kosteneffectieve methode kunt vertaling gebeurtenissen worden gevisualiseerd in cellen om te bestuderen hoe RNA-bindende proteïnen reguleren metastatische processen, zoals cellulaire hechting, migratie en invasie.
<p class="jove_…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canada) voor de kritische lezing van het manuscript. Wij danken de cel Imaging eenheid van het Research Center voor hun technische bijstand. M.-É. Huot is een Junior 1 onderzoeker van het Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen nummer CIHR, MOP-286437 naar M.-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
Referências
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
