Summary

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Published: August 22, 2017
doi:

Summary

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Abstract

Die Mechanismen zur Regulierung der mRNA Übersetzung sind in verschiedenen biologischen Prozessen, wie z. B. Entwicklung von Keim, Zelldifferenzierung und Organogenese, sowie mehrere Krankheiten beteiligt. Zahlreiche Publikationen haben überzeugend gezeigt, dass spezifische Mechanismen eng mRNA Übersetzung regulieren. Verstärktes Interesse an der Übersetzung-induzierte Verordnung der Proteinexpression führte zur Entwicklung neuer Methoden zu studieren und de Novo Protein Synthese in Cellulofolgen. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex, so dass sie kostspielig und häufig Begrenzung der Anzahl der mRNA-Ziele, die studiert werden kann. Dieses Manuskript schlägt eine Methode, die erfordert nur grundlegende Reagenzien und konfokale Fluoreszenz-imaging-System zu messen und zu visualisieren, die Änderungen in der Übersetzung der mRNA, die in jede Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen auftreten. Diese Methode wurde vor kurzem zur lokalisierte Übersetzung in die subzellulären Strukturen der adhärenten Zellen über einen kurzen Zeitraum hinweg, bietet somit die Möglichkeit der Visualisierung de Novo Übersetzung für eine kurze Zeit während einer Vielzahl von biologischen zeigen Prozesse oder Änderungen in translational Aktivität in Reaktion auf bestimmte Reize zu validieren.

Introduction

Die Regulierung der Übersetzung durch verschiedene Zellfunktionen veranlasste viele Forschungsgruppen zu entwickeln, neue Werkzeuge und Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von mRNA Übersetzung und regulierte Protein Synthese1,2 ,3,4. Diese jüngsten technologischen Fortschritte ermöglichen ein besseres Verständnis der Mechanismen, bei denen Übersetzung Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs bei biologischen Prozessen wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung5 ,6,7,8. Die meisten dieser Methoden erfordern jedoch teuer oder gefährlichen Reagenzien und spezielle Ausrüstung, die möglicherweise nicht die meisten Laboratorien zur Verfügung. Als solche wurde eine kostengünstige Methode ermöglicht die schnelle Beurteilung der Übersetzung Veranstaltungen entwickelt, um speziell diese potenzielle Probleme zu umgehen. Diese Methode erkennt akute translationale Modulationen, die auftreten, während spezifische zelluläre Prozesse und ermöglicht auch für die Lokalisierung der Übersetzung mit der konfokalen Mikroskopie.

Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um lokalisierte Übersetzung innerhalb subzelluläre Kompartimente genannt Verbreitung Einleitung-Center (SIC)5zu überwachen. SICs sind vorübergehende Strukturen gefunden in gesetzte Zellen, die auf der Oberseite entstehende Haftung komplexe lokalisiert sind. Obwohl SICs und Adhäsion komplexe unterscheiden, sind ihre Schicksale eng verbunden. In der Tat SICs bekannt, um auf komplexe fokale Adhäsion Reifung zu einem Haftung während der Anfangsphase der Adhäsion allmählich. Wir fanden, dass RNA-bindende Proteine bekannt, um mRNA Übersetzung (z. B. Sam68, FMRP und G3BP1) gezielt zu steuern und Polyadenylated RNAs, innerhalb dieser angereichert wurden Strukturen5. Mit den beschriebenen Methoden hier, haben wir gezeigt, dass die Regulierung der SIC-assoziierte mRNA Übersetzung wirkt als ein Checkpoint erlaubt Zellen zur Konsolidierung der Zelladhäsion gesät. Diese Methode, basierend auf Puromycin Aufnahme konnte eine angepasste Version der Oberfläche Sensing Übersetzung Assay (Sonnenuntergang) betrachtet werden. Ursprünglich entwickelt, um globale Protein Synthese mit einem nicht radioaktiv markierte Aminosäure messen, bietet Protein Puromycilation eine effiziente Möglichkeit, de Novo Protein Synthese9zu visualisieren. Diese Methode beruht auf das innere Verhalten von Puromycin, ein Antibiotikum, das Übersetzung durch vorzeitigen Kettenabbruch in den Ribosom10blockiert. In der Tat ist Puromycin strukturell analog zu Tyrosyl-tRNA, wodurch für den Einbau in Peptidketten über die Bildung einer Peptidbindung verlängern. Puromycin Bindung an eine wachsende Peptid-Kette verhindert jedoch eine neue Peptidbindung gebildet wird mit der nächsten Aminoacyl-tRNA, da Puromycin eine nicht wasserlöslicher Amid-Bindung anstelle der wasserlöslicher Esterbindung in tRNAs gefunden hat. So entsteht die Einbeziehung von Puromycin in Polypeptide verlängern in der vorzeitigen Veröffentlichung von zahlreichen abgeschnittene Puromycilated Polypeptide entsprechend aktiv übersetzten mRNA9,11,12 .

Mit dieser Methode war es möglich, innerhalb kurzer Zeit Witwe aktive Übersetzung bewerten (z. B. 5 min.) während zellulare Adhäsion über einen spezifischen Antikörper gegen Puromycin auf Zellen, die über einen Zeitraum von 5 Minuten mit dem Antibiotikum ergänzt wurden verarbeiten Sie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Zelladhäsion5. Die Genauigkeit dieser Assay stützt sich auf hochspezifische Antikörper gegen die Puromycilated glyko-gerichtet. Immunofluorescent Erkennung des Polypeptids Puromycilated bietet eine allgemeine subzelluläre Verteilung der neu übersetzten mRNA, die auch mit großer Genauigkeit mit konfokale bildgebenden Systemen quantifiziert werden kann.

Daher bietet diese Methode eine entsprechende Option für eine große Anzahl von Laboren Studium translationale Regulationsmechanismen in Prozesse wie neuronale Granulation6,13,14, 15, Morphogen mRNA Lokalisierung und Übersetzung während der Entwicklung16,17. Es eignet sich auch gut zum Studium lokalisierte oder unterteilte Übersetzung während der schnellen biologischen Ereignisse, wie Zellwanderung, Haftung oder Invasion oder einfach beurteilen medikamentöse Behandlungen, die translational Änderungen5, induzieren könnte 7 , 18. insgesamt ermöglicht diese Methode zur Visualisierung von lokalisierten oder kontrollierte Übersetzung Ereignisse auf eine schnelle, genaue und kostengünstige Weise.

Protocol

1. Bestimmung der Puromycilation Bedingungen Hinweis: Diese Technik beschreibt die Methode verwendet, um lokalisierte Übersetzung während der MRC-5 Zelle Adhäsion Prozess 5 bewerten. Als Puromycilation in einer beliebigen Zelle getan werden kann, ist es wichtig, die Puromycilation Bedingungen für die spezifische Zelllinien verwendet werden, zu optimieren, da die Behandlungsbedingungen für jede Zelllinie in Bezug auf die Puromycin-Konzentration und die gewünschte …

Representative Results

Um Übersetzung Ereignisse mithilfe von Puromycin Aufnahme genau zu beobachten, ist es wichtig, die optimale Bedingungen für jede Zelllinie zu bestimmen, da jeder unterschiedliche Puromycin Einbeziehung Kinetik (Abbildung 1)9,11 zeigt ,12,18. Daher um Puromycin Aufnahme zu überprüfen, ist es notwendig, die gewünschte Zell-Linie…

Discussion

Jüngsten technologischen Fortschritte haben für ein besseres Verständnis der Mechanismen translationale Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs in biologischen Prozessen, wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung zulässig. Die kostengünstige Methodik, die hier beschriebenen lässt die Übersetzung Ereignisse in Zellen zu studieren, wie RNA-bindende Proteine regulieren metastatische Prozesse, wie z. B. zelluläre Adhäsion, Migration und Invasion visualisiert werden.

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Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Zelle Bildtrommel des Forschungszentrums für ihre technische Unterstützung. M.-É. Huot ist ein Junior 1 Research Scholar des Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (Anzahl CIHR, MOP-286437, M.-É zu gewähren. Huot).

Materials

DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25000
Immunofluoresence dilution 1:10000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

Referências

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Citar este artigo
Bergeman, J., Huot, M. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

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