मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस वैश्विक स्थानीयकृत अनुवाद मापने के लिए
Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन एक विधि कल्पना और उपसेलुलर डिब्बों में स्थानीयकृत अनुवाद घटनाओं को बढ़ाता है । इस पांडुलिपि में प्रस्तावित दृष्टिकोण एक बुनियादी फोकल इमेजिंग प्रणाली और रिएजेंट की आवश्यकता है और तेजी से और लागत प्रभावी है ।
Abstract
mRNA अनुवाद विनियमन तंत्र विभिंन जैविक प्रक्रियाओं, जैसे रोगाणु लाइन विकास, कोशिका विभेद, और organogenesis, साथ ही कई रोगों में शामिल हैं । कई प्रकाशनों के कायल है कि विशिष्ट तंत्र कसकर mRNA अनुवाद को विनियमित दिखाया है । प्रोटीन अभिव्यक्ति के अनुवाद प्रेरित नियमन में वृद्धि हुई ब्याज उपंयास तरीकों के विकास के लिए अध्ययन करने के लिए और cellulo में डी नोवो प्रोटीन संश्लेषण का पालन करने के लिए प्रेरित किया है । हालांकि, इन तरीकों की सबसे जटिल हैं, उंहें महंगा बना रही है और अक्सर mRNA लक्ष्य है कि अध्ययन किया जा सकता है की संख्या सीमित । इस पांडुलिपि को मापने के लिए और विभिन्न स्थितियों के तहत किसी भी सेल लाइन में होते हैं कि mRNA अनुवाद में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए केवल बुनियादी रिएजेंट और एक फोकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली की आवश्यकता है कि एक विधि का प्रस्ताव. इस विधि हाल ही में समय की एक छोटी अवधि में अनुयाई कोशिकाओं के उपसेलुलर संरचनाओं में स्थानीयकृत अनुवाद दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, इस प्रकार जैविक की एक किस्म के दौरान एक छोटी अवधि के लिए de नोवो अनुवाद visualizing की संभावना की पेशकश प्रक्रियाओं या विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में शोधों गतिविधि में परिवर्तन मांय की ।
Introduction
विभिंन सेलुलर कार्यों द्वारा अनुवाद का विनियमन कई अनुसंधान टीमों को प्रेरित किया है mRNA अनुवाद और विनियमित प्रोटीन संश्लेषण के उपसेलुलर स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए नए उपकरणों और तरीकों को विकसित करने के लिए1,2 ,3,4. ये हाल ही में तकनीकी अग्रिम अनुवाद विनियमन या जैविक प्रक्रियाओं के दौरान विशिष्ट mRNAs के दमन, जैसे न्यूरॉन विकास, दवा की प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस के रूप में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देते हैं5 ,6,7,8. हालांकि, इन तरीकों में से अधिकांश महंगी या खतरनाक रिएजेंट और सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है कि विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है । जैसे, एक लागत प्रभावी तरीका अनुवाद घटनाओं के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देने के लिए विशेष रूप से इन संभावित मुद्दों को दरकिनार विकसित किया गया था । इस विधि विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान होते हैं और भी फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अनुवाद के स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है कि तीव्र शोधों मॉडुलन का पता लगाता है.
यहां वर्णित तरीके उपसेलुलर डिब्बों के भीतर स्थानीयकृत अनुवाद की निगरानी के लिए दीक्षा केंद्र (सिक)5प्रसार बुलाया इस्तेमाल किया गया । SICs नवजात आसंजन परिसरों के शीर्ष पर स्थानीयकृत कर रहे हैं कि अस्तव्यस्त कोशिकाओं में पाया क्षणिक संरचनाओं रहे हैं । हालांकि SICs और आसंजन परिसरों अलग हैं, उनके भाग्य बारीकी से जुड़े हुए हैं । दरअसल, SICs एक आसंजन साइट में आसंजन के आरंभिक चरण के दौरान फोकल आसंजन जटिल परिपक्वता पर धीरे से गायब हो जाते हैं । हमने पाया है कि आरएनए-बंधन प्रोटीन विशेष रूप से mRNA अनुवाद (जैसे, Sam68, FMRP, और G3BP1) को नियंत्रित करने के लिए जाना जाता है और polyadenylated RNAs इन संरचनाओं के भीतर5समृद्ध थे । यहां वर्णित विधियों का उपयोग करके, हमने दिखाया है कि सिक-संबद्ध mRNA अनुवाद का विनियमन एक चौकी के रूप में कार्य करता है जिससे कोशिका आसंजन को समेकित करने के लिए बीज कोशिकाओं की अनुमति होती है । इस विधि, puromycin निगमन पर आधारित है, अनुवाद परख (सूर्यास्त) की सतह संवेदन के एक अनुकूलित संस्करण माना जा सकता है । मूल रूप से वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण की माप करने के लिए विकसित एक गैर रेडियोधर्मी लेबल अमीनो एसिड का उपयोग कर, प्रोटीन puromycilation de नोवो प्रोटीन संश्लेषण9कल्पना करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है. इस विधि puromycin, एक एंटीबायोटिक है कि ribosome10में समय से पहले श्रृंखला समाप्ति के माध्यम से अनुवाद ब्लॉक के आंतरिक व्यवहार पर निर्भर करता है । दरअसल, puromycin संरचनात्मक रूप से tyrosyl के अनुरूप है-tRNA, जो एक पेप्टाइड बॉण्ड के गठन के माध्यम से पेप्टाइड श्रृंखला में शामिल करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, puromycin एक बढ़ती पेप्टाइड श्रृंखला के लिए बाध्यकारी अगले aminoacyl-tRNA के साथ गठन किया जा रहा से एक नया पेप्टाइड बांड रोकता है, के बाद से puromycin एक गैर hydrolysable hydrolysable में पाया एस्टर बांड के बजाय बांड के बीच है । इस प्रकार, कई कटा हुआ puromycilated polypeptides के समयपूर्व रिलीज में polypeptides परिणाम में puromycin के शामिल होने के लिए सक्रिय रूप से अनुवादित mRNA9,11,12 .
इस विधि का प्रयोग, यह एक कम समय विधवा के भीतर सक्रिय अनुवाद का आकलन करने के लिए संभव था (जैसे, 5 मिनट) सेलुलर आसंजन के दौरान एक विशिष्ट puromycin के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी कोशिकाओं है कि एंटीबायोटिक के साथ 5-ंयूनतम अवधि के लिए पूरक थे पर निर्देश सेल आसंजन प्रक्रिया के दौरान अलग समय बिंदुओं पर5। इस परख की परिशुद्धता अत्यधिक विशिष्ट puromycilated moiety के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर करता है । puromycilated पॉलीपेप्टाइड के Immunofluorescent पता लगाने के नए अनुवादित mRNA, जो भी महान सटीकता के साथ मात्रा किया जा सकता है की एक सामांय उपसेलुलर पुनर्विभाजन प्रदान करता है फोकल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर ।
इसलिए, इस विधि के लिए एक प्रासंगिक विकल्प प्रदान करता है प्रयोगशालाओं का अध्ययन शोधों नियामक प्रक्रियाओं में शामिल ऐसे न्यूरॉन दानेदार6,13,14, 15, morphogen mRNA स्थानीयकरण, और अनुवाद के दौरान विकास16,17. यह भी अच्छी तरह से इस तरह के सेल प्रवास, आसंजन, या आक्रमण के रूप में तेजी से जैविक घटनाओं, के दौरान स्थानीयकृत या compartmentalized अनुवाद का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है, या केवल अनुवाद परिवर्तन पैदा हो सकता है कि दवा उपचार का आकलन5, 7 , 18. कुल मिलाकर, इस विधि में स्थानीयकृत या नियंत्रित अनुवाद घटनाओं के दृश्य के लिए अनुमति देता है एक तेजी से, सटीक, और लागत प्रभावी तरीका.
Protocol
1. Puromycilation शर्तों का निर्धारण
नोट: यह तकनीक MRC-5 सेल आसंजन प्रक्रिया के दौरान स्थानीयकृत अनुवाद का आकलन करने के लिए प्रयुक्त विधि का वर्णन करता है ५ . के रूप में puromycilation किसी भी कोशि…
Representative Results
Discussion
हाल ही में तकनीकी विकास के लिए शोधों में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति दी है विनियमन या जैविक प्रक्रियाओं में विशिष्ट mRNAs के दमन, जैसे कि ंयूरॉन विकास, दवा की प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस । लाग?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Dr. Rachid Mazroui (विश्विद्यालय लवल, Québec, कनाडा) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए अनुसंधान केंद्र के सेल इमेजिंग इकाई को धन्यवाद देते हैं । एम.-É. Huot के शौकीनों de सूक्ष्म du Québec-Santé (FRQ-S) के एक जूनियर 1 अनुसंधान विद्वान है । इस कार्य को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (अनुदान संख्या CIHR, आरोग्य-२८६४३७ को एम.-É के द्वारा समर्थित किया गया. Huot) ।
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
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