정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역
Summary
이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.
Abstract
MRNA 번역 조절 메커니즘 여러 질병에서 뿐만 아니라 세균 선 개발, 세포 분화, organogenesis, 등 다양 한 생물학 과정에서 포함 된다. 다 수의 출판물에서는 특정 메커니즘 단단히 mRNA 번역 규제 설득 나타났습니다. 단백질 식의 번역 유도 규칙에 대 한 관심 증가 연구 하 고 de novo 단백질 합성에서 cellulo에따라 새로운 방법의 개발을 주도하 고 있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 복잡 한, 그들이 비용이 많이 드는 고 공부 될 수 있다 mRNA 대상의 수를 제한 하는 자주. 이 원고만 기본적인 시 약 및 측정 하 고 다양 한 조건에서 어떤 셀 라인에서 발생 하는 mRNA 번역에 변화를 시각화 confocal 형광 이미징 시스템을 필요로 하는 방법을 제안 합니다. 이 메서드는 최근 시간, 따라서 생물 다양 한 동안 짧은 기간에 대 한 드 노 보 번역 시각화의 가능성을 제공 하는 짧은 기간 동안 부착 셀의 subcellular 구조에서 지역화 된 번역을 표시 하는 데 사용 됩니다. 프로세스 또는 특정 자극에 응답에서 변환 활동에 변화를 확인.
Introduction
다른 세포질 기능에 의해 번역의 규칙 새로운 도구와 mRNA 번역 및 규제 단백질 합성1,2 의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법을 개발 하기 위해 많은 연구 팀을 묻는 메시지가 있다 ,34. 이러한 최근의 기술 진보에 대 한 번역 upregulation 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이5 같은 생물 학적 과정 동안 특정 mRNAs의 억압 메커니즘의 향상 된 이해 허용 ,6,,78. 그러나, 이러한 방법의 대부분 비싼 또는 유해 시 약 및 특정 장비를 대부분 실험실을 사용할 수 없는 필요 합니다. 따라서, 번역 이벤트의 급속 한 평가 대 한 허용 하는 비용 효율적인 방법은 구체적으로 이러한 잠재적인 문제를 회피 하 개발 되었다. 이 방법은 특정 세포 프로세스 동안 발생 하는 급성 변환 변조 감지 및 또한 번역 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 지역화에 대 한.
여기에 설명 된 방법은 확산 개시 센터 (SIC)5라는 subcellular 구획 내에서 지역화 된 번역을 모니터링 하는 데 사용 되었다. SICs 과도 구조 초기 접착 단지 위에 지역화 된 시드 셀에 있습니다. SICs 및 접착 단지 가지는, 비록 그들의 운명은 밀접 하 게 연결 됩니다. 실제로, SICs 접착의 초기 단계 동안 접착 사이트에 초점 접착 복잡 한 성숙에 점차적으로 사라질 알려져 있습니다. 우리는 발견 특히 mRNA 번역 (예를 들어, Sam68, FMRP, 및 G3BP1)을 제어 하려면 알려진 RNA 의무적인 단백질 및 RNAs 이러한 내에서 농축 된 polyadenylated 구조5. 여기 설명 된 방법을 사용 하 여, 우리는 SIC 관련 mRNA 번역 검사점 수 역할의 규칙 세포 세포 접착을 통합 시드 보였다. Puromycin 설립에 따라이 메서드는 적응된 버전의 번역 분석 결과 (일몰) 표면 감지의 간주 될 수 있습니다. 원래는 비 방사성 레이블이 아미노산을 사용 하 여 글로벌 단백질 합성 속도 측정을 개발, 단백질 puromycilation de novo 단백질 합성9를 시각화 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 방법은 puromycin, 번역 리보솜10조 체인 종료를 차단 하는 항생제의 고유 동작에 의존 합니다. 실제로, puromycin tyrosyl-tRNA, 펩 티 드 사슬 펩 티 드 결합의 형성을 통해 elongating으로 수 있는 구조적으로 유사한 이다. 그러나, 성장 펩 티 드 사슬에 puromycin 바인딩 puromycin tRNAs에서 발견 hydrolysable 에스테 르 결합 대신 비 hydrolysable 아 미드 유대를가지고 있기 때문에 다음 aminoacyl-tRNA와 함께 형성 되 고에서 새로운 펩 티 드 결합을 방지 합니다. 따라서, polypeptides를 elongating에 puromycin의 설립 적극적으로 번역 mRNA9,11,12에 해당 하는 수많은 잘린된 puromycilated polypeptides의 조기 출시에 결과 .
짧은 시간과 부 내에서 활성 번역 평가 가능 했다이 메서드를 사용 하 여 (예를 들어, 5 분) 동안 puromycin 항생제 5 분 동안 보충 된 셀에 대 한 지시는 특정 항 체를 사용 하 여 세포 접착 세포 접착 하는 동안 다른 시간 지점에서5를 처리 합니다. 이 분석 결과의 정밀도 높은 특정 항 체에 대하여 puromycilated moiety 지시에 의존 합니다. Puromycilated polypeptide의 immunofluorescent 감지 또한 confocal 이미징 시스템을 사용 하 여 좋은 정확성과 계량 수 새로 번역 된 mRNA의 일반적인 subcellular 재분할을 제공 합니다.
이 방법은 신경 알갱이 만듦6,,1314, 등의 프로세스에 관련 된 변환 규제 메커니즘을 공부 하는 실험실의 많은 수에 대 한 관련 옵션을 제공 하는 15, morphogen mRNA 지역화, 그리고 개발16,17동안 번역. 그것은 또한 급속 한 생물 학적 이벤트, 셀 이동, 접착, 또는 침략, 또는 단순히 변환 변경5, 를 일으킬 수 있는 약물 치료를 평가 하기 위해 동안 지역화 된 또는 compartmentalized 번역을 공부 하는 데 적합 7 , 18. 전반적으로,이 메서드를 사용 하면 지역화 된 또는 제어 번역 이벤트의 시각화를 위한, 정확, 신속 하 고 비용 효율적인 방식으로.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근의 기술 진보는 변환 upregulation에 관련 된 메커니즘의 이해 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이 등의 생물학적 프로세스에서 특정 한 mRNAs의 억압에 대 한 수 있다. 여기에 설명 된 비용 효율적인 방법론 번역 이벤트를 RNA 의무적인 단백질 세포 접착, 마이그레이션, 및 침략 등의 전이성 프로세스를 규제 하는 방법을 공부 하는 셀에 구상 될 수 있습니다.
수많은 방법은 de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고의 중요 한 읽기에 감사 박사 Rachid Mazroui (라 발 대학교, 퀘벡, 캐나다) 하 고. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 연구 센터의 세포 이미징 단위 감사. M. É. Huot는 Fonds 드의 주니어 1 연구 학자 검색 뒤 퀘벡-건강 (FRQ-S). 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (번호 CIHR, 걸 레-286437 M. É를 부여에 의해 지원 되었다 합니다. Huot)입니다.
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
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