Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse
Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for å visualisere og kvantifisere lokaliserte oversettelse hendelser i subcellular rom. Tilnærmingen foreslått i dette manuskriptet krever en grunnleggende AC confocal imaging system og reagenser og er rask og kostnadseffektiv.
Abstract
Mekanismer regulere mRNA oversettelse er involvert i ulike biologiske prosesser, som bakterie linje utvikling, celledifferensiering og organogenesen, samt flere sykdommer. Flere publikasjoner har overbevisende vist at spesifikke mekanismene tett regulere mRNA oversettelse. Økt interesse oversettelse-indusert regulering av protein uttrykk har ført til utvikling av nye metoder å studere og følge de novo protein syntese i cellulo. De fleste av disse metodene er imidlertid kompleks, noe som gjør dem dyrt og ofte begrenser antall mRNA mål som kan studeres. Dette manuskriptet foreslår en metode som krever bare grunnleggende reagenser og en AC confocal fluorescens tenkelig system for å måle og visualisere endringene i mRNA oversettelse oppstår i enhver celle linje under ulike forhold. Denne metoden ble nylig brukt vil vise lokaliserte oversettelse i subcellular strukturer av tilhenger celler over en kort periode, dermed tilby se de novo oversettelse for en kort periode under en rekke biologiske prosesser eller validere endringer i translasjonsforskning aktivitet som svar på bestemte stimuli.
Introduction
Regulering av oversettelse av cellulære funksjoner har bedt mange forskergrupper å utvikle nye verktøy og metoder for å bestemme den subcellular lokaliseringen av mRNA oversettelse og regulert protein syntese1,2 ,3,4. Disse siste teknologiske fremskritt tillate for en bedre forståelse for mekanismene oversettelse oppregulering eller undertrykkelse av bestemte mRNAs under biologiske prosesser, som neuronal utvikling, narkotika-respons og metastasering5 ,6,7,8. Men krever de fleste av disse metodene dyre eller farlige reagenser og bestemt utstyr som ikke kanskje er tilgjengelig for de fleste laboratorier. Som sådan, ble en kostnadseffektiv metode til å tillate rask vurdering av oversettelse hendelser utviklet for å spesifikt omgå disse potensielle problemer. Denne metoden oppdager akutt translasjonsforskning modulasjoner som oppstår under bestemte cellulære prosesser og gir også mulighet for lokalisering av oversettelse med AC confocal mikroskopi.
Metodene som er beskrevet her ble brukt til å overvåke lokaliserte oversettelse i subcellular rom kalt spre innvielsen sentre (SIC)5. SICs er forbigående strukturer i seeded celler som er lokalisert på begynnende vedheft komplekser. Selv om SICs og vedheft komplekser er distinkte, er deres skjebne nært knyttet. Faktisk er SICs kjent for å gradvis forsvinner ved fokal vedheft komplekse modning til et vedheft område under den innledende fasen av vedheft. Vi fant ut at RNA-bindende proteiner kjent spesielt kontrollere mRNA oversettelse (f.eks Sam68, FMRP og G3BP1) og polyadenylated RNAs ble beriket innenfor disse strukturer5. Bruke metodene som er beskrevet her, viste vi at regulering av SIC-assosiert mRNA oversettelse fungerer som en checkpoint tillater seeded celler å konsolidere celleadhesjon. Denne metoden, basert på puromycin innlemmelse, kan anses som en tilpasset versjon av overflaten sensing oversettelse analysen (solnedgang). Opprinnelig utviklet for å måle globale protein syntese priser ved bruk av en ikke-radioactively merket aminosyre, tilbyr protein puromycilation en effektiv måte å visualisere de novo protein syntese9. Denne metoden er avhengig av iboende atferden til puromycin, et antibiotikum som blokkerer oversettelse gjennom tidlig kjeden oppsigelse i ribosom10. Faktisk er puromycin strukturelt analoge til tyrosyl-tRNA, som tillater for inkorporering elongating peptid kjeder via dannelsen av et peptid bånd. Puromycin binding til en voksende peptid kjede hindrer imidlertid en ny peptid bånd blir dannet med det neste aminoacyl-tRNA, siden puromycin har et ikke-hydrolysable amid bånd i stedet for hydrolysable ester bond i tRNAs. Dermed resulterer inkorporering av puromycin i elongating polypeptides i tidlig utgivelsen av mange avkortet puromycilated polypeptides tilsvarer aktivt oversatt mRNA9,11,12 .
Bruker denne metoden, det var mulig å vurdere aktive oversettelse innen kort tid enke (f.eks 5 min) under cellular vedheft ved hjelp av et spesifikt antistoff rettet mot puromycin på celler som ble supplert med antibiotikaet for 5 minutters perioder behandle5på ulike tidspunkt under celle vedheft. Presisjonen for denne analysen er avhengig av svært spesifikke antistoffer rettet mot puromycilated moiety. Immunofluorescent påvisning av puromycilated polypeptid gir en generell subcellular repartisjonere av den nylig oversatte mRNA, som også kan kvantifiseres nøyaktig med AC confocal imaging-systemer.
Derfor gir denne metoden et relevant alternativ for mange laboratorier studere translasjonsforskning regulatoriske mekanismer involvert i prosesser som neuronal korning6,13,14, 15morphogen mRNA lokalisering og oversettelse under utvikling16,17. Det er også godt egnet til å studere lokaliserte eller compartmentalized oversettelse under rask biologiske hendelser som celle migrasjon, heft eller invasjon eller bare vurdere medikamentelle behandlinger som kan indusere translasjonsforskning endringer5, 7 , 18. samlet denne metoden tillater for visualisering av lokaliserte eller kontrollert hendelser i en rask, nøyaktig og kostnadseffektiv måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyere teknologiske fremskritt har lov for en bedre forståelse for mekanismene som er involvert i translasjonsforskning oppregulering eller undertrykkelse av bestemte mRNAs i biologiske prosesser, som neuronal utvikling, narkotika-respons og metastasering. Kostnadseffektiv metodikk beskrevet her kan oversettelse hendelser kan visualiseres i cellene for å studere hvordan RNA-bindende proteiner regulere metastatisk prosesser, som cellular vedheft, migrasjon og invasjon.
Selv om mange metoder fo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Quebec, Canada) for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker celle Imaging enheten forskningssenteret for deres kundestøtte. M.-É. Huot er Junior 1 stipendiat av de Fonds Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske institutter for helseforskning (gi nummer CIHR, MOPP-286437 til M.-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
Referências
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
- Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
- Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
- Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
- El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
- Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
- Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
- Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
- Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
- Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
- Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
- Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
- Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
- Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
- Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
- Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).
