Este manuscrito descreve métodos para a aplicação de tecnologia de microarrays de péptidos para o perfil específico de anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-tradução.
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Artigo de método
Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As modificações pós-translacionais (PTMs) nas proteínas das histonas são amplamente estudadas quanto aos seus papéis na regulação da estrutura da cromatina e da expressão gênica. A produção em massa e a distribuição de anticorpos específicos para as PTM das histonas facilitaram grandemente a pesquisa nessas marcas. Como os anticorpos PTM das histonas são reagentes-chave para muitas aplicações de bioquímica de cromatina, a análise rigorosa da especificidade do anticorpo é necessária para a interpretação precisa dos dados e o progresso contínuo no campo. Este protocolo descreve uma tubagem integrada para o projeto, fabricação e uso de microarrays de péptidos para perfilar a especificidade de anticorpos de histonas. Os aspectos de design e análise deste procedimento são facilitados pelo ArrayNinja, um pacote de software de código aberto e interativo desenvolvido recentemente para simplificar a personalização de formatos de impressão em microarray. Este pipeline foi usado para exibir um grande número de antibióticos de histona PTM, amplamente utilizados e comercializados.S, e os dados gerados a partir dessas experiências estão disponíveis gratuitamente através de um banco de dados de especificações de anticorpos de histona online e em expansão. Além das histonas, a metodologia geral aqui descrita pode ser aplicada amplamente à análise de anticorpos específicos de PTM.
Introdução
O DNA genômico é embalado elegantemente dentro do núcleo da célula eucariótica com proteínas histonas para formar cromatina. A subunidade de repetição da cromatina é o nucleossoma, que consiste em 147 pares de bases de DNA envolvidos em torno de um núcleo octamerico de proteínas histonas - H2A, H2B, H3 e H4 1 . A cromatina é amplamente organizada em eucromatina vagamente compactada e domínios de heterocromatina bem embalados. O grau de compactação da cromatina regula a medida em que as máquinas de proteínas podem acessar o DNA subjacente para realizar processos fundamentais de DNA, tais como replicação, transcrição e reparo.
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Protocolo
1. Instalando e executando ArrayNinja
- Baixe e instale o Oracle Virtual Box de www.virtualbox.org.
- Baixe e descomprima a máquina virtual ArrayNinja (VM) de http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
- Abra a caixa virtual e adicione a VM ArrayNinja clicando em 'Máquina', 'Adicionar' e selecione arrayninja.vbox na pasta onde ArrayNinja VM foi salvo.
- Inicie o ArrayNinja selecionando-o dentro da Caixa Virtual e clicando na seta verde 'Iniciar'.
- A Caixa Virtual abrirá uma nova janela e exibirá uma mensagem de que a VM pode ser acessada navegando no navegador da Web para localhost: 2080.60; NOTA: uma v....
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Resultados
Este protocolo tem sido usado para projetar e fabricar uma plataforma de microarrays de péptidos para a análise da especificidade de anticorpos de PTM das histonas. A matriz consulta uma biblioteca de mais de 300 características peptídicas únicas (20 a 40 resíduos de comprimento) representando muitas das combinações conhecidas de PTMs encontradas nas proteínas histonas núcleo e variante 38 . Este pipeline tem sido um campo de trabalho para a triagem de muitos anti.......
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Discussão
A confiabilidade de anticorpos em aplicações de pesquisa biomédica é primordial 46 , 47 . Isto é especialmente verdadeiro na bioquímica da cromatina, dada a posição dos anticorpos como ferramentas-chave para a maioria das técnicas desenvolvidas para caracterizar a abundância e distribuição de PTM de histonas. O protocolo apresentado aqui detalha um pipeline otimizado para o projeto, fabricação e uso de microarrays de péptidos para analisar a especificidade de an.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Van Andel Research Institute e uma bolsa de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (CA181343) para SBR
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Impressão Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated microscópio de vidro slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polipropileno 384 placa de poço | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotina-fluoresceína | Sigma | 53608 | |
| contato impressora de microarray | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Impressora |
| Microarray Impressora de microarray de contato | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Caneta de cera hidrofóbica | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Barreira hidrofóbica PAP Caneta |
| de silicone Junta | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Vaso de Hibridização | Thermo Scientific | 267061 | ou vaso similar |
| Anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-coelho) |
| Anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Cera Impressora | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | ou scanner de microarray equivalente |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Motivo ativo de matriz de peptídeos | 13001 | ||
| Microarrays de peptídeos de código de histona | JPT | His_MA_01 | |
| cera | Royal Oak | GulfWax | para impressão de cera |
| de hibridização de slides de microarray umidificado | VWR | 97000-284 | |
| Câmara de lavagem de lâminas de microscópio de alto rendimento | ArrayIt | HTW | |
| Microscópio centrífuga de lâminas | VWR | 93000-204 | |
| Anticorpo 1 | Abcam | 8898 | |
| Anticorpo 2 | Millipore | 07-473 | |
| Peptídeo de histona biotinilada | EpiCypher | 12-0001 | Exemplo de peptídeo. Peptídeos semelhantes com várias modificações estão disponíveis em várias fontes comerciais. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Referências
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
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Reimpressões e permissões
