생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 – 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.
인간 조혈 줄기 세포 (HSC)는 골수 (BM) 틈새에 존재하며, 골수 (cytokines), 성장 인자 및 세포 외 기질을 생산하는 복잡한 요소입니다. HSC가 정지 상태, 자체 갱신 또는 분화 상태를 유지하고 돌연변이를 획득하고 악성이 될 수있는 능력은 다른 간질 성분으로 확립 된 복잡한 상호 작용에 달려 있습니다. 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 사람의 HSC와 사람의 BM 틈새 사이의 누화를 관찰하기 위해 우리는 면역 결핍 마우스에서 인간의 BM 틈새를 대칭 적으로 모델링하고 이미지화하기위한 프로토콜을 설계했습니다. 우리는 다른 세포 구성 요소의 사용이 인간화 된 구조의 형성과 장기적인 인간 조혈 생존을 유지할 수있는 기회를 제공한다는 것을 보여줍니다. 2 광자 현미경을 사용하여 인간 BM의 기능적 특성 분석을위한 강력하고 새로운 도구를 제공하여 단일 셀 분해능 으로 현장 에서 이러한 구조 를 실시간으로 이미지화 할 수 있습니다미세 환경과 정상 및 악성 조혈 조절에있어 그 역할.
줄기 세포 구획에서 관찰 된 세포 운명 결정은 내재적 요인과 외인성 요인 모두에 의해 엄격히 규제됩니다. 특히, 지금은 널리 BM 미세 환경이 자신의 자기 갱신 또는 분화의 운명 결정 (1)에서뿐만 아니라, 활성 상태로 대기에서 조혈 모세포의 스위치를 제어에 근본적인 역할을 인정 받고 있습니다. 또한 최근 연구 결과에 따르면 혈액 학적 악성 종양이 BM 미세 환경의 기능에 영향을 미치므로 두 구획 2 , 3 , 4 , 5 , 6 사이의 활성 크로스 토크가 있음을 나타냅니다. 최근의 진보에도 불구하고 특정 BM 틈새 요소의 활동이 HSC 행동 및 악성 형질 전환에 어떻게 기여하는지에 대한 많은 주요 질문이 남아 있습니다.
BM의 미세 환경은 고도로 헤테로이다. 다양하고 다양한 세포 유형의 풍부하고 복잡한 혼합물. 각 세포는 특수 기능을 갖추고 있습니다. 풍부한 내피 (EC)와 혈관 성분은 영양소와 대사 산물의 회전율, BM으로 들어가고 나오는 다른 세포의 유입과 유출, 그리고 몇몇 HSC 기능을 조절합니다 7 , 8 . 간세포 간질 세포 (MSCs)는 세 가지 다른 계통 ( 즉, 골 형성, 연골 형성, 지방 형성)을 통해 이루어진 미분의 줄기 세포와 전구 세포의 이종 집단으로, BM 틈새의 또 다른 기본 요소이다. 이 MSCs는 BM의 중앙 영역과 골밀도 영역에 근접하여 위치합니다. 혈관 구조와 관련이있을 수 있으며 HSC 기능의 조절에 관여합니다 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"14 , 15 .
많은보고에 의하면 HSC는 골수 내 다양한 부위에 존재하며 그 기능은 정확한 국소화에 달려 있다고합니다. HSCs와 BM 미세 환경과의 상호 작용에 관한 현재 지식의 대부분은 쥐 연구 1 에서 파생됩니다. 이종 이식 모델의 사용은 인간의 정상 및 악성 HSC에 대한 지식을 확장시켜 면역 결핍 성 마우스의 BM 생쥐 16 , 17 , 18 , 19 , 20 에 이식했습니다. 이것이 유효한 모델이지만, 인간 마우스의 HSC 유도 및 생식 또는 종간 장벽과 세포 – 세포 상호 작용에 대한 잘 알려지지 않은 영향을 고려하여 대부분의 경우 수령 마우스를 컨디셔닝해야 할 필요성과 같은 많은 과제를 여전히 나타냅니다. 기능.
중화 항체와 유전자 변형 마우스의 사용은 이종 이식과 함께 인간의 조혈 줄기 세포가 그들의 미세 환경으로 확립하는 복잡한 대화를 강조하는데 중요하다. intravital 2 광자 공 촛점 현미경의 도입과 개발은 이러한 연구를 한 단계 발전시켜 골수 19 , 20 , 21 , 22 의 직접, 고해상도 및 동적 이미징을 가능하게하고 기능적으로 강력한 도구를 제공합니다 BM 미세 환경의 특성 및 HSC 기능 조절에 미치는 역할 고전적 이종 이식 모델에서 발생하는 문제의 일부를 회피하기 위해 인간화 된 BM 구조를 조작하는 개념이 전면에 제기되었습니다. 생체 적합 물질과 세포 이식 개념의 융합으로 인간의 뼈를 모방하는 가능성이 나타났다.heterotopic 지역에서 화살표 microenvironment 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . 이는 조혈 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 종양 및 전이 40, 41, 42, 인간의 정상 및 악성 연구를 마우스 모델에서 생체 공학의 사용 가능성을 연다 , 43 , 44 .
뼈 조직 공학 및 생체 내 이미징에 이전 경험을 바탕으로 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 우리는 생체 공학 및 라이브 이미지 organotypic 인간의 BM 조직 프로토콜을 설명합니다. 이러한 구조는 인간의 BM 유래 간질 세포를 면역 결핍 마우스에 피하 이식 된 콜라겐 기반 인공 지지체에 이식 한 것에서 유래한다. 이전 보고서에서, 우리는 인간 중간 엽 줄기 세포는 인간의 조혈 세포 (45)의 생착에 적합한 인간 미세 환경의 형성을 보장 있음을 보여 주었다. 또한, 여기에 다른 인간 BM 세포 성분의 동시 주입 (co-implantation)인간 내피 세포 (hEC) 및 / 또는 뼈 형성에 중요한 사이토 카인 ( 예 : hBMP2)은 hMSC와 협력하여 현장에서 라이브 이미지 로 만들 수있는 다양한 인간화 미세 환경을 생성합니다.
기존 방법에 대한 의의 :
이 프로토콜에서는 마우스에서 다른 인간화 된 미세 환경을 생성하고 2 광자 현미경 및 조직학을 통해 구조를 시각화하는 방법을 설명했습니다. 제공된 대표 데이터는 인간화 된 조직을 조작하기 위해 다른 기질 세포를 사용하여 접근법의 실현 가능성을 보여줍니다. 프로토콜은 정상 및 병리학 조건에서 인간 조혈 세포 및 골수 틈새 파생 세포의 연구에 특정 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 이러한 응용 프로그램에는 clonal 진화, 약물 스크리닝, 인간 HSC와 간질 구성 요소 간의 누화에 대한 연구가 포함됩니다. 신흥 조직 공학 분야에서 몇 가지 대안이 제안되었다. 주목해야 할 것은 in vitro에서 의 3D 인간화 된 BM 구조의 개발이다. 55 , 56 , 57 ,58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 및 생쥐에서 인간화 된 BM 인공 지지체의 orthotopic 이식 64 . 우리의 접근 방식은 생체 내 시스템의 복잡성과 인간화 된 조직 이식편의 쉬운 해부학 적 접근성을 결합하는 이점이 있습니다.
수정 및 문제 해결 :
이 프로토콜의 가변성의 근원은 스캐 폴드를 시드하는 데 사용되는 세포의 선택에서 찾을 수 있습니다. 우리 연구에서 BM 유래 hMSCs를 사용했습니다. 그러나 간엽 세포는 여러 조직에서 얻을 수 있으며, 기원에 따라 특이한 성질을 나타낼 수 있습니다. 따라서 다른 기관에서 유래 된 hMSCs의 사용을 고려할 수 있습니다. 그러나, 생체 내에서 뼈 조직을 형성하는 능력은이 p에서 사용하기 전에 검사해야합니다이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 인간 내피 세포 공급원 ( 즉, E4ORF1- 형질 전환 된 HUVEC)을 사용합니다. 최근, 다양한 목적으로 특정 기관의 내피 세포의 사용, (66) (65)에보고되었다. 또한, BM에서 유래 한 1 차 hECs의 사용은 프로토콜에 대한 흥미로운 개선을 나타낼 수있다. 따라서, 내피 세포의 상이한 공급원의 사용은 생체 내 결과가 상이 할 수있다.
우리는 인간화 된 인공 지지체의 이식을 선호하고 조직 거부를 피하기 위해 NSG 면역 저하 수용 마우스를 사용했다. 우리는 다른 마우스 변종에서 이소성 골수 조직을 조작하기 위해이 프로토콜을 사용할 가능성을 배제하지 않습니다. 실제로, rhBMP-2는 다른 포유류 모델 47 , 48 , 49 , 50 에서 골 형성을 유도 할 수있다 <sup>, 52 . 그러나 세포 생존력과 장기 이식의 차이는 다른 균주 / 모델을 사용하여 관찰 될 수 있습니다.
스캐 폴드 회복 시점은 실험의 최종 목적에 따라 유연 할 수 있습니다. 제시된 프로토콜에서 우리는 장기간 조혈 생장을 평가하기 위해 이식 후 8-12 주에 샘플을 회수합니다. 인간의 BM 틈새 형성 ( 예 : osteochondral tissue formation 47 또는 혈관 발달)의 초기 단계를 연구하기 위해 다른 시점을 선택할 수 있습니다.
우리가이 프로토콜에서 설명한 라이브 이미징 기술은 explants의 단기 이미징에 표시됩니다. 생리적 온도, 산소 장력 및 CO 2 농도를 유지하기위한 평형화 챔버의 사용은 운동 동작을 연구하기 위해 같은 장기 영상의 경우에 고려되어야한다.
크리티컬 스트리트프로토콜 내의 eps :
프로토콜과 관련된 과제 중 몇 가지 단계에 필요한 기술적 인 기술을 강조합니다. 중간 엽 줄기 세포와 내피 세포는 낮은 세포 수로 사용되어야한다. 그렇지 않으면 생체 내에서 인간 조혈 세포 이식을 지원하거나 생체 내 에서 신생 혈관 및 뼈 형성 에 참여할 수 없습니다. 인공 지지체 준비 및 세포 파종 단계는 기본적인 세포 배양 기술과 절차에 사용 된 특정 세포의 특성에 대한 지식이 필요합니다. 수술 프로토콜은 매우 간단하지만 연습이 필요합니다. 면역 결핍 마우스에서 이식 된 인공 지지체의 오염을 피하기 위해 무균 환경을 유지하는 것이 실험의 성공을 보장하는 데 중요합니다. 샘플 explant 및 라이브 이미징 수술 연습 (특히 microdrill의 사용)과 지식이 필요합니다현미경 시스템. 마지막으로, 표본 처리 및 조직학은 사용될 기술에 대한 기본 지식을 필요로합니다.
기술의 한계 :
우리가 기술 한 접근법은 사람의 내피 세포가 뼈 / 골수 공간을 형성하는 혈관 구조 및 중간 엽 세포를 형성하면서, 인간화 된 골수 미세 환경을 파종 한 살아있는 인간 조혈 세포의 시각화를 가능하게합니다. 조직이 생체 내 에서 형성됨 에 따라, 최종 조작 된 비계는 여전히 키메라 (인간 및 쥐) 일 것이다. 이 문제는 키메라 조직이 사람의 골수의 복잡성과 환경을 완전히 모방하지 않기 때문에 고려되어야합니다.
이식 된 지지대는 크기가 제한되어 있으므로 (최대 6.6 x 7.5 x 7 mm 시도) 이종 이식을 위해 제한된 수의 세포를 접종 할 수 있습니다. 회수 된 세포의 절대 개수도 제한됩니다. 따라서, 이식 된 인공 지지체의 수는실험에 필요한 세포 수의 함수로 계산됩니다.
우리가 묘사 한 영상 응용은 특히 건축물을 파괴하거나 세포를 손상시키지 않으면 서 150-200 μm의 깊이에서 살아있는 조직의 넓은 영역을 관찰하는데 유용합니다. 따라서, 그것은 전체 발판의 시각화를 허용하지 않습니다. 조직을 완전히 스캔해야한다면 표준적인 면역 형광법이 더 적절할 것입니다.
미래의 응용 분야 :
이 생체 공학 모델의 미래 방향은 조직에서 인체 구성 요소의 복잡성을 증가시키는 것입니다. 인간 BM 틈새의 지식과 특성은 최근 몇 년 동안 진행되어 왔고 , 기술 된 프로토콜은이 새로운 세포 구성 요소와 용해성 인자의 기능뿐만 아니라 정상 / 악성지지에 대한 역할을 연구하는 흥미로운 플랫폼이 될 수있다.개미 HSC.
또한, 이미징 기술은 수술 후 회복과 생체 마취 생쥐의 발판을 이미징에 기술적 개선을 필요로 종단 연구에서 발판의 intravital 이미징을위한 잠재력을 제공합니다. 이 접근법은 추가 단계가 필요하며 현재 실험실에서 조사 중입니다.
The authors have nothing to disclose.
귀중한 도움을 얻기 위해 Francis Crick Institute (생물학 연구 시설, 생체 내 이미징 및 실험 조직 병리학)의 핵심 시설 및 Yolanda Saavedra-Torres 및 Mercedes Sanchez-Garzon (Crick 및 LRI의 수의사)에게 감사드립니다. 비판적으로 원고를 읽으면서 Dr. W. Gray에게 감사드립니다. DP는 EHA의 비 임상 연구 펠로우쉽에 의해 지원되었다. 이 연구는 Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045) 및 Welcome Trust (FC001045)의 핵심 기금을받는 Francis Crick Institute의 지원을 받았다.
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |