En metod för att skapa och levande bild olika humaniserade benmärgsnischer i möss presenteras. Baserat på den stödjande nischen som skapas av humana mesenkymceller inducerar tillsättningen av humana endotelceller bildandet av humana kärl, medan tillsatsen av rhBMP-2 inducerar bildningen av human-mus-chimär mogen benvävnad.
Humana hematopoetiska stamceller (HSCs) ligger i benmärgs (BM) nischen, ett invecklat multifaktoriellt nätverk av komponenter som producerar cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulär matris. HSCs förmåga att förbli vilande, självförnya eller differentiera och förvärva mutationer och bli maligna beror på de komplexa interaktioner som de etablerar med olika stromkomponenter. För att observera överensstämmelsen mellan humana HSC och den humana BM-nischen i fysiologiska och patologiska förhållanden, utformade vi ett protokoll för ektopisk modell och bildar en humaniserad BM-nisch i immunofrekventa möss. Vi visar att användningen av olika cellulära komponenter möjliggör bildandet av humaniserade strukturer och möjligheten att bibehålla långvarig humant hematopoietisk engraftment. Med hjälp av tvåfotonmikroskopi kan vi levande bilda dessa strukturer in situ vid encellsupplösningen, vilket ger ett kraftfullt nytt verktyg för den funktionella karakteriseringen av humant BM mMikromiljö och dess roll vid reglering av normal och malign hematopoiesis.
Cellbeslutsbeslut som observeras i stamcellerna regleras tätt av både inneboende och extrinsiska faktorer. I synnerhet är det nu allmänt erkänt att BM-mikromiljön spelar en grundläggande roll vid styrning av omkopplaren i HSCs från en vila till ett aktivt tillstånd, såväl som i deras självförnyelse eller differentierings ödet 1 . Vidare visar nya fynd att hematologiska maligniteter påverkar BM-mikromiljöns funktion, vilket pekar på förekomsten av aktiv korsning mellan de två facken 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Trots de senaste framstegen kvarstår många viktiga frågor om hur aktiviteten av specifika BM-nischkomponenter bidrar till HSC-beteende och malign transformation.
BM mikromiljö är en mycket heterogent Enous och komplex blandning av många olika celltyper, var och en med specialiserade funktioner. Den rikliga endoteliala (EC) och vaskulära komponenten reglerar omsättning av näringsämnen och metaboliter, ingressen och utgången från olika celler till och från BM och flera HSC-funktioner 7 , 8 . Mesenkymala stromceller (MSC), en heterogen population av odifferentierade stamceller och föregångare begåtta genom tre olika linjer ( dvs osteogen, kondrogent, adipogen) är en annan grundläggande del av BM-nischen. Dessa MSC lokaliserar både i centrala områden av BM och i närheten av endosteal regionen. De kan vara associerade med vaskulära strukturer och är inblandade i regleringen av HSC-funktionen 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .
Många rapporter tyder på att HSCs bor i olika definierade platser inom margen och att deras funktion kan bero på deras exakta lokalisering. De flesta av den nuvarande kunskapen om HSCs och deras interaktion med BM mikromiljö härrör från murina studier 1 . Användningen av xenograftmodeller har utökat denna kunskap till humana normala och maligna HSCs, engrafting inom murin BM av immunbristande möss 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Även om detta representerar en giltig modell, presenterar den fortfarande många utmaningar, såsom behovet att betinga mottagarmusen i de flesta fall för att tillåta humant HSC-homing och engraftment eller cross-species barriären och dess dåligt förstådda inflytande på cell-cell-interaktioner och funktioner.
Användningen av neutraliserande antikroppar och genetiskt modifierade möss, tillsammans med xenotransplantation, har bidragit till att markera den komplexa dialog som mänskliga HSCs etablerar med sina mikroenheter. Introduktionen och utvecklingen av intravital två-foton-konfokalmikroskopi har flyttat dessa studier ett steg framåt, vilket möjliggör direkt, högupplösning och dynamisk bildbehandling av benmärgen 19 , 20 , 21 , 22 och ger ett kraftfullt verktyg för funktionell Karakterisering av BM mikromiljö och dess roll vid reglering av HSC-funktionen. För att kringgå några av de problem som uppstår i klassiska xenotransplantationsmodeller har begreppet teknik en humaniserad BM-struktur tagits fram. Sammanslagning av biomaterial och cellimplantationskoncept, rapporter har visat möjligheten att efterlikna humant benmPilmikromiljö i heterotopområdena 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Detta öppnar möjligheten att använda bioengineering i musmodeller för att studera human normal och malign hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumörgenes och metastaser 40 , 41 , 42 , 43, 44.
Baserat på tidigare erfarenhet av benvävnadsteknik och in vivo- bildbehandling 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beskriver vi ett protokoll till bioengineer och levande bildorganotiska humana BM-vävnader. Dessa strukturer härrör från implanteringen av humana BM-härledda stromaceller till kollagenbaserade ställningar subkutant ympade i immunbristande möss. I en tidigare rapport visade vi att mänskliga MSC säkerställer bildandet av en human mikromiljö som är tillräcklig för engraftment av humana hematopoetiska celler 45 . Dessutom beskriver vi hur samimplantationen av andra humana BM-cellkomponenterS, såsom humana endotelceller (hEC) och / eller cytokiner som är viktiga för benbildning ( t.ex. hBMP2), samarbetar med hMSCs för att generera olika humaniserade mikromiljöer, som kan vara levande avbildade in situ .
Betydelse med befintliga metoder:
I detta protokoll beskrev vi en metod för att generera olika humaniserade mikromiljöer i möss och att visualisera sin arkitektur via tvåfotonmikroskopi och histologi. De angivna representativa uppgifterna visar möjligheten av tillvägagångssättet, med användning av olika stromceller för att manipulera humaniserade vävnader. Protokollet har specifika tillämpningar på studien av humana hematopoietiska celler och benmärgs nisch-härledda celler under normala och patologiska förhållanden. Dessa applikationer innefattar studien av klonal evolution, läkemedelsscreening och crosstalk mellan humana HSC och stromala komponenter. I det framväxande området för vävnadsteknik har flera alternativa tillvägagångssätt föreslagits. Tillvägagångssätt för notering innefattar utvecklingen av 3D humaniserade BM-strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 och det ortopotopiska implantatet av humaniserade BM-byggnadsställningar i möss 64 . Vårt tillvägagångssätt har fördelen att kombinera både komplexiteten hos in vivo- systemet med den lättanatomiska tillgängligheten hos det humaniserade vävnadstransplantatet.
Ändringar och felsökning:
En variabelkälla i detta protokoll finns i valet av celler som används för att frösta byggnadsställena. I vårt arbete använde vi BM-härledda hMSCs. Mesenkymceller kan emellertid erhållas från flera vävnader, vilka kan uppvisa särskiljande egenskaper beroende på ursprunget. Därför kan användningen av hMSC som härrör från olika organ beaktas. Emellertid bör deras förmåga att bilda benvävnad in vivo testas före användning i denna pRotokoll. Detta protokoll använder en kommersiellt tillgänglig human endotelcellerkälla ( dvs. E4ORF1-transducerad HUVEC). Nyligen har användningen av organspecifika endotelceller för olika ändamål rapporterats 65 , 66 . Vidare kan användningen av primära hEC härledda från BM representera en intressant förbättring av protokollet. Därför kan användningen av olika källor av endotelceller ge olika in vivo- resultat.
Vi använde NSG-immunkompromitterade mottagande möss för att gynna implantationen av humaniserade byggnadsställningar och för att undvika vävnadsavstötning. Vi utesluter inte möjligheten att använda detta protokoll för att konstruera ektopiska benmärgsvävnader i andra musstammar. I själva verket kan rhBMP-2 inducera benbildning i olika däggdjursmodeller 47 , 48 , 49 , 50 <sup>, 52 . Däremot kan skillnader i cellleabilitet och långtidstransplantation observeras med olika stammar / modeller.
Tidpunkten för byggnadsåterställning kan också vara flexibel, beroende på experimentets slutliga syfte. I det presenterade protokollet återställer vi prover vid 8 – 12 veckor efter implantation för att bedöma långvarig hematopoietisk engraftment. För att studera tidiga steg i den humana BM-nischedningen ( t.ex. osteokondral vävnadsbildning 47 eller vaskulär utveckling) kan olika tidspunkter väljas.
Den levande bildteknik som vi beskrivit i detta protokoll är indikerad för kortvarig bildbehandling av explanter. Användningen av en jämviktad kammare för att upprätthålla fysiologisk temperatur, syrspänning och CO 2 -koncentration bör övervägas vid långvarig avbildning, såsom att studera motilitetsbeteenden.
Kritisk StEps inom protokollet:
Bland de utmaningar som är relaterade till protokollet framhävs de tekniska färdigheter som krävs för några steg. Mesenkymala och endotelceller bör användas vid lågcellspassagerantal; Annars kommer de inte att kunna stödja humant hematopoietisk cell engraftment in vivo eller att delta i de novo vaskulatur och benbildning in vivo . Vi rekommenderar användning av hMSCs och hECs vid passagerna 1 – 5. Förberedelser av städe och cellsåtning kräver grundläggande cellkultur färdigheter och kunskap om egenskaperna hos de specifika celler som används i proceduren. Operationsprotokollet är ganska enkelt men kräver viss övning. Underhåll av en aseptisk miljö för att undvika kontaminering av de implanterade ställningarna i immunoförmögen möss är avgörande för att försökets framgång ska lyckas. Provplanta och levande bildbehandling kräver kirurgisk praxis (speciellt för användning av mikrodrill) och kunskap omMikroskop system. Slutligen kräver provbehandling och histologi grundläggande kunskaper om de tekniker som ska användas.
Begränsningar av tekniken:
Tillvägagångssättet beskriver vi möjliggör visualisering av levande humana hematopoietiska celler som sårar en humaniserad benmärgsmikro-miljö, med mänskliga endotelceller som bildar vaskulära strukturer och mesenkymceller som bildar ben / benmärgsutrymme. När vävnaden bildas in vivo , kommer den slutgiltiga byggnadsställningen fortfarande att vara chimär (human och murin). Denna fråga bör beaktas, eftersom den chimära vävnaden kanske inte fullständigt efterliknar mänsklig benmärgskomplexitet och miljö.
Plåtarna implanterade har en begränsad storlek (vi försökte maximalt 6,6 x 7,5 x 7 mm) och kan därför vara värd för ett begränsat antal celler för xenotransplantation. Det absoluta antalet återvunna celler kommer också att vara begränsat; Således bör antalet implanterade byggnadsställningarBeräknas som en funktion av antalet celler som krävs för experimentet.
Den avbildningsapplikation som vi beskrivit är speciellt användbar för att observera stora områden av levande vävnad vid djup 150-200 um från ytan utan att störa arkitekturen och skada cellerna. Därför tillåter det inte visualisering av hela ställningen. Om en fullständig avsökning av vävnaden är nödvändig skulle vanliga immunofluorescensmetoder vara mer lämpliga.
Framtida applikationer:
Den framtida riktningen för denna biotekniska modell skulle vara att öka komplexiteten hos de humana komponenterna i vävnaden. Kunskapen och karakteriseringen av den mänskliga BM-nischen har utvecklats under de senaste åren 67 och det beskrivna protokollet kan vara en intressant plattform för att studera funktionen hos dessa nya cellulära komponenter och lösliga faktorer, liksom deras roll i att stödja normal / malignAnt HSCs.
Vidare ger bildteknik potentialen för intravital bildbehandling av byggnadsställningarna i longitudinella studier, vilket skulle kräva tekniska förbättringar för att avbilda byggnadsställningarna i levande, bedövade möss med återvinning efter kirurgi. Detta tillvägagångssätt skulle kräva ytterligare steg och undersöks för närvarande i laboratoriet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar personalen i kärnanläggningarna vid Francis Crick Institute (Biologisk Forskningsfacilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) och Yolanda Saavedra-Torres och Mercedes Sanchez-Garzon, veterinärerna vid Crick och LRI, för deras värdefulla hjälp. Vi är tacksamma för Dr. W. Gray för att kritiskt läsa manuskriptet. DP stöddes av ett icke-kliniskt stipendium från EHA. Detta arbete stöddes av The Francis Crick Institute, som mottar sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045) och Welcome Trust (FC001045).
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |