Semiautomated langsgående Microcomputed CT-baseret kvantitative strukturel analyse af en nøgen rotte osteoporose Vertebral fraktur Model
Summary
Målet med denne protokol er at generere en nøgen rotte osteoporose vertebrale kompression fraktur model, der kan være på langs evalueres i vivo ved hjælp af en semiautomated microcomputed CT-baseret kvantitative strukturel analyse.
Abstract
Osteoporose vertebrale kompressionsfrakturer (OVCFs) er et fælles og klinisk uopfyldte behov med stigende udbredelse som verdens befolkning aldre. OVCF dyremodeller er afgørende for de prækliniske udvikling af translationel tissue engineering strategier. Mens en række modeller i øjeblikket findes, beskriver denne protokol en optimeret metode for at fremkalde flere meget reproducerbare vertebrale defekter i en enkelt nøgen rotte. En roman langsgående semiautomated microcomputed tomografi (µCT)-baseret kvantitative strukturel analyse af vertebrale fejl er også detaljeret. Kort, rotter blev afbildet på flere gang point post-op. Dag 1-scanningen blev omlagt til en standard position, og en standard mængde af interesse blev defineret. Efterfølgende µCT scanninger af hver rotte blev automatisk registreret til dag 1 scan så den samme mængde af interesse blev derefter analyseret for at vurdere for ny knogledannelse. Denne alsidige tilgang kan tilpasses til en række andre modeller, hvor langsgående imaging-baseret analyse kunne drage fordel af præcise 3D semiautomated justering. Tilsammen beskriver denne protokol en let kvantificerbare og let at reproducere system for osteoporose og knogle forskning. Den foreslog protokol tager 4 måneder til at fremkalde osteoporose i nøgen ovariectomized rotter og mellem 2,7 og 4 h at generere, billede og analysere to vertebrale defekter, afhængigt af væv størrelse og udstyr.
Introduction
Mere end 200 millioner mennesker verden over lider af osteoporose1. Den underliggende patologiske fald i mineralske knogletæthed (BMD) og ændrede knogle mikroarkitektur øge knogle skrøbelighed, og dermed den relative risiko for fraktur2. Osteoporose er så udbredt og til skade for sundhed, WHO har defineret det et alvorligt folkesundhedsproblem. Desuden, som verdens befolkning ventes at alder, osteoporose forventes at blive endnu mere udbredt.
Osteoporotiske vertebrale kompressionsfrakturer er de mest almindelige skrøbelighed frakturer, anslås til mere end 750.000 om året i USA. De er forbundet med betydelig morbiditet og så meget som en ni-gange højere dødelighed Vurder3. I kliniske forsøg, blev i øjeblikket tilgængelige kirurgisk indgreb, såsom vertebroplasty og kyphoplasty, fundet for at være nogen mere effektiv end en fingeret behandling4,5, forlader kun smertebehandling tilgængelige til disse patienter. Da nuværende OVCF behandlinger er begrænset, er det nødvendigt at udvikle en dyremodel, der kan kopiere lidelse6,7,8. Sådanne animal modeller kunne lette undersøgelsen af nuværende behandlingsmetoder og udviklingen af nye terapier, der vil oversætte i klinisk praksis. Osteoporose er blevet induceret og vedholdende i model dyr gennem administrationen af en lav-calcium kost (LCD) i forbindelse med ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. til yderligere model knogletab tilknyttet OVCFs, vertebrale knogledefekter blev etableret i osteoporotiske immunkompetente rotter 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. I dette arbejde, er en vertebrale defekt model af immunkompromitterede rotter med modellerede osteoporose præsenteret. Denne nye model kan bruges til at vurdere cellebaserede behandlinger der omfatter stamceller afledt af forskellige kilder og arter med henblik på reparation af udfordrende frakturer, såsom OVCFs.
Knogle imaging er en afgørende del af evalueringen af frakturer og knoglesygdomme. Avanceret billedbehandling metoder blev udviklet til den præcise vurdering af strukturelle knogle ændringer og regenerering strategier25. Blandt dem fremstod µCT imaging som en non-invasiv, nem at bruge og billig metode, der giver høj opløsning 3D-billeder. µCT imaging har flere fordele sammenlignet med andre modaliteter i evaluering osteoporosepatienter, da det giver høj opløsning 3D knogle mikroarkitektur26 der kan derefter analyseres kvantitativt. Sidstnævnte kan derefter bruges til at sammenligne de terapeutiske virkninger af foreslåede behandlinger. Faktisk, i vivo µCT imaging er en guld standard for vertebrale defekt regenerering overvågning1,16,27. Men få publikationer28,29,30,31 har ansat automatiseret registrering værktøjer til at minimere bruger-afhængighed, interpolation bias og præcision fejl af µCT Imaging-baseret analyse. For nylig, var vi de første til at bruge en registreringsprocedure til at forbedre analysen af knogle regenerering i en standardiseret knogle void, som forklaret i denne protokol32 .
Metoden beskrevet her kan bruges til at studere effekten af roman celle terapier for OVCFs, uhindret af vært T-celle respons, kan afvise allogene eller xenogene celler. Osteoporose er induceret hos unge rotter gennem ovariectomy (OVX) og 4 måneder på en LCD-skærm. Den unge alder af OVX rotter, kombineret med LCD, gav os mulighed at nå frem til en lav peak knoglemasse, efterligne postmenopausale osteoporose ved fører til irreversible knogletab. Dette kan forklares dels af det faktum, at under LCD og henne ved omkring 3 måneder i alder, rotter overgangen fra knoglen modellering til remodellering fase på den lændehvirvlerne33, hvilket øger sandsynligheden for, at opretholde osteoporose over tid. Ved hjælp af unge dyr gør denne model mere omkostningseffektive, som de koster mindre. Ikke desto mindre, det er begrænset af i sagens natur ikke tegner sig for de biologiske ændringer i den aldrende dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporose er den mest udbredte årsag til vertebrale kompressionsfrakturer forårsaget af en øget belastning på ryggen og dette resultat i sammenbrud af vertebrale kroppen. Men det er praktisk umuligt at generere en skade i en gnaver, der autentisk replikater en lignende vertebrale sammenbrud. I stedet, forskere skabe en cylindrisk tomrum i midten af vertebrale kroppen til at efterligne OVCFs16,17,18,<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen blev støttet af en bevilling fra California Institute for regenerativ medicin (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
Referências
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
