Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist eine nackte im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompression Bruch Rattenmodell zu generieren, die längs bewertet in Vivo mit einer parallelisierter Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse werden können.
Abstract
Im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompressionsfrakturen (OVCFs) sind eine gemeinsame und klinisch ungedeckten Bedarf mit zunehmender Prävalenz als die Bevölkerung altert. OVCF Tiermodelle sind unerlässlich, um die präklinische Entwicklung von translational Tissue engineering Strategien. Während eine Reihe von Modellen derzeit vorhanden sind, beschreibt dieses Protokoll eine optimierte Methode zur Induktion von mehreren hoch reproduzierbare Wirbelkörper Mängel in eine einzige nackte Ratte. Eine neuartige längs parallelisierter Microcomputed Tomographie (µCT)-auf der Grundlage quantitative Strukturanalyse der Wirbelkörper Mängel ist auch detailliert. Kurz, wurden Ratten auf mehrere Zeit Punkte postoperative abgebildet. Tag 1-Scan wurde neu ausgerichtet, um eine standard-Position und einem Standardvolumen von Interesse war definiert. Nachfolgende µCT-Scans von jede Ratte wurden automatisch zum Tag 1 Scan registriert, so dass die gleiche Menge an Interesse anschließend analysiert wurde, um für neue Knochenbildung zu bewerten. Dieser vielseitige Ansatz kann zu einer Vielzahl anderer Modelle angepasst werden, wo Imaging-basierte Längsschnittanalyse von präzise 3D parallelisierter Ausrichtung profitieren könnten. Zusammen genommen, beschreibt dieses Protokoll ein leicht quantifizierbare und leicht reproduzierbare System für Osteoporose und Knochen. Das vorgeschlagene Protokoll dauert 4 Monate induzieren Osteoporose in nude ovariectomized Ratten und zwischen 2,7 und 4 h zu generieren, Bild und zwei Wirbelkörper Mängel je nach Gewebe Größe und Ausstattung zu analysieren.
Introduction
Mehr als 200 Millionen Menschen weltweit leiden an Osteoporose1. Die zugrunde liegenden pathologischen Abnahme der Knochendichte (BMD) und veränderten Knochen Mikroarchitektur zu erhöhen, Knochenbrüchigkeit und infolgedessen das relative Risiko von Frakturen2. Osteoporose ist so weit verbreitet und schädlich für die Gesundheit die WHO eine große Gesundheitsproblem definiert hat. Darüber, wie die Weltbevölkerung Alter erwartet wird, Osteoporose dürfte sogar noch häufiger geworden.
Osteoporotische Wirbelkörper-Kompressionsfrakturen sind die häufigsten Zerbrechlichkeit Frakturen, schätzungsweise mehr als 750.000 pro Jahr in den USA. Sie sind verbunden mit erheblicher Morbidität und so viel wie ein neun-Mal höhere Sterblichkeit3. In klinischen Studien derzeit verfügbaren chirurgische Eingriffe, wie z. B. Vertebroplastie und Kyphoplastie, erwiesen sich nicht wirksamer als ein Schein Behandlung4,5, diese Patienten nur Schmerztherapie zur Verfügung überlassen. Da aktuelle OVCF Behandlungen begrenzt sind, ist es unerlässlich, ein Tiermodell zu entwickeln, die die Störung6,7,8replizieren kann. Solchen Tiermodellen konnte erleichtern, die Untersuchung der aktuellen Behandlungsmethoden und der Entwicklung neuartiger Therapien, die in die klinische Praxis umsetzen wird. Osteoporose wurde induziert und nachhaltig in Tiermodellen durch die Gabe einer niedrigen Kalzium Ernährung (LCD) in Verbindung mit Ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. um den Knochenverlust verbunden mit OVCFs weiter zu modellieren, Wirbelkörper Knochendefekte entstanden im osteoporotischen immunkompetenten Ratten 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In dieser Arbeit wird ein Wirbelkörper defekt-Modell von immungeschwächten Ratten mit modellierten Osteoporose vorgestellt. Dieses neue Modell lässt sich beurteilen, zellbasierte Therapien mit Stammzellen aus verschiedenen Quellen und Arten für die Reparatur von anspruchsvollen Frakturen, wie z. B. OVCFs.
Knochen-Bildgebung ist ein wesentlicher Bestandteil der Bewertung von Frakturen und Knochenerkrankungen. Moderne bildgebende Verfahren wurden für die genaue Beurteilung der strukturellen Knochenveränderungen und Regeneration Strategien25entwickelt. Unter anderem entstanden µCT Bildgebung als eine nicht-invasive, einfach zu bedienende und kostengünstige Methode, die hochauflösende 3D Bilder liefert. µCT-Bildgebung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Modalitäten bei der Bewertung von Osteoporose-Patienten, da es bietet hochauflösende 3D Knochen Mikroarchitektur26 , das anschließend quantitativ analysiert werden können. Letzteres kann dann verwendet werden, um die therapeutische Wirkung der vorgeschlagenen Behandlungen zu vergleichen. In der Tat ist in Vivo µCT-Bildgebung ein Goldstandard für die Regeneration der Wirbelsäule defekt Überwachung1,16,27. Jedoch haben einige Publikationen28,29,30,31 eingesetzt automatisierte Registrierung Tools Benutzer-Abhängigkeit, Interpolation Voreingenommenheit und Präzision Fehler der µCT zu minimieren Imaging-basierte Analyse. Vor kurzem waren wir die ersten ein Registrierungsverfahren zu verwenden, um die Analyse der Knochenregeneration in einen standardisierten nichtig, Knochen zu verbessern, wie in diesem Protokoll32 erläutert.
Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um die Wirkung von neuartiger Zelltherapien für OVCFs zu untersuchen, ungehindert vom Host T-Zell-Reaktionen, die xenogene oder allogene Zellen ablehnen könnte. Osteoporose ist bei jungen Ratten durch Ovariectomy (OVX) und 4 Monaten ein LCD induziert. Das junge Alter der OVX Ratten, kombiniert mit dem LCD erlaubt, um einen niedrigen maximalen Knochenmasse, postmenopausalen Osteoporose imitiert, indem Sie zu irreversiblen Knochenverlust führt zu erreichen. Dies lässt sich teilweise durch die Tatsache, dass, während der LCD-Anzeige auf ca. 3 Monate alt, die Ratten Übergang vom Knochen zur Umgestaltung Modellierung an den Lendenwirbeln33, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Aufrechterhaltung der Osteoporose über phase Zeit. Verwendung von jungen Tieren macht dieses Modell kostengünstiger, da sie weniger Kosten. Dennoch ist es begrenzt durch die biologischen Veränderungen im Altern Tier von Natur aus nicht entfallen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporose ist die häufigste Ursache der vertebralen Kompressionsfrakturen, verursacht durch eine erhöhte Belastung auf die Wirbelsäule und dazu führen, dass der Zusammenbruch des Wirbelkörpers. Allerdings ist es praktisch unmöglich, eine Verletzung in einem Nagetier zu generieren, die einen ähnlichen Wirbelkörper Zusammenbruch authentisch repliziert. Stattdessen erstellen Forscher eine zylindrische leere in der Mitte des Wirbelkörpers, OVCFs16,17,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) (TR2-01780) unterstützt.
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
Referências
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