Semiautomated langsgående Microcomputed tomografi-baserte kvantitative strukturelle analyser av en naken rotte osteoporose-relaterte vertebrale frakturer modell
Summary
Målet med denne protokollen er å generere en naken rotte osteoporose-relaterte ryggvirvel kompresjon brudd modell som kan langs evaluert i vivo med en semiautomated microcomputed tomografi-baserte kvantitative strukturelle analyser.
Abstract
Osteoporose-relaterte ryggvirvel kompresjon brudd (OVCFs) er vanlige og klinisk udekkede behov med økende utbredelsen som verden befolkningen aldre. OVCF dyremodeller er avgjørende for prekliniske utviklingen av translasjonsforskning tissue engineering strategier. Mens en rekke modeller finnes, beskriver denne protokollen en optimalisert metode for å indusere flere svært reproduserbar ryggvirvel defekter i en enkelt naken rotte. En roman langsgående semiautomated microcomputed tomografi (µCT)-basert kvantitative strukturell analyse av ryggvirvel feil er også beskrevet. Kort, rotter ble fotografert på flere tid poeng post-op. Dag 1 skanningen var reorientert til en standard posisjon, og et standardvolum rundt ble definert. Etterfølgende µCT skanninger av hver rotte ble automatisk registrert på dag 1 skanningen så samme volum av interesse ble deretter analyseres for å vurdere for nye bein-formasjonen. Denne allsidige kan tilpasses en rekke andre modeller der langsgående imaging-baserte analyser kan ha nytte av nøyaktig 3D semiautomated justering. Samlet beskriver denne protokollen en lett kvantifiserbare og å reprodusere system for osteoporose og bein. Det foreslåtte protokollen tar 4 måneder å indusere osteoporose i naken ovariectomized rotter og mellom 2.7 og 4 h å generere bilde og analysere to ryggvirvel defekter, avhengig av vev størrelsen og utstyr.
Introduction
Mer enn 200 millioner mennesker over hele verden, lider av osteoporose1. Den underliggende patologisk nedgang i beinmineraltetthet (BMD) og endret bein mikroarkitektur øke bein skjørhet og følgelig relativ risiko brudd2. Osteoporose er så utbredt og skadelig for helse at WHO har definert det en stor offentlig helse bekymring. Videre som verdens befolkning er forventet alder, forventes osteoporose å bli enda mer vanlig.
Osteoporotic ryggvirvel kompresjon brudd er de vanligste skjørhet frakturer, anslått til mer enn 750 000 i året i USA. De er tilknyttet betydelig sykelighet og så mye som en ni ganger høyere dødelighet3. I kliniske forsøk, ble for tiden tilgjengelig tiltak, som vertebroplasty og kyphoplasty, funnet for å være ingen mer effektiv enn en humbug behandling4,5, etterlot bare smerte ledelse tilgjengelig til disse pasientene. Siden gjeldende OVCF behandlinger er begrenset, er det viktig å utvikle en dyremodell som replikeres lidelse6,7,8. Slike dyr modeller kan lette både etterforskningen av gjeldende behandlingsmetoder og utviklingen av romanen terapi som vil oversette til klinisk praksis. Osteoporose er indusert og opprettholdes i modellen dyr gjennom administrasjonen av en lav-kalsium diett (LCD) sammen med ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. for å ytterligere modell bentap tilknyttet OVCFs, ryggvirvel bein mangler ble etablert i osteoporotic immunkompetente rotter 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. I dette arbeidet vises en ryggvirvel feil modell av immunsupprimerte rotter med modellerte osteoporose. Denne nye modellen kan brukes til å vurdere celle-basert behandling med stamceller hentet fra ulike kilder og arter for reparasjon av utfordrende frakturer, som OVCFs.
Bein imaging er en viktig del av evalueringen av frakturer og bein sykdommer. Avansert tenkelig metoder ble utviklet for nøyaktig vurdering av strukturelle bein endringer og gjenfødelse strategier25. Blant dem, har µCT bildebehandling framstått som en ikke-invasiv, enkel å bruke og rimelig metode som gir høyoppløselig 3D-bilder. µCT bildebehandling har flere fordeler sammenlignet med andre modaliteter i evalueringen osteoporose pasienter, som det gir høy oppløsning 3D bein mikroarkitektur26 som så kan analyseres kvantitativt. Sistnevnte kan deretter brukes til å sammenligne terapeutiske effekter av foreslåtte behandlinger. I vivo µCT imaging er faktisk en gull-standard for ryggvirvel defekt regenerering overvåking1,16,27. Men har noen publikasjoner28,29,30,31 ansatt automatisert registrering verktøy å minimere den brukeren-avhengighet, interpolering bias og presisjon feil av µCT Imaging-basert analyse. Nylig var vi først til å bruke en registrering prosedyre for å forbedre analysen av bein gjenfødelse et standardisert bein veddemål, som forklart i denne protokollen32 .
Metoden beskrevet her kan brukes til å studere effekten av romanen cellen terapi for OVCFs, uhindret av verten T-cell svar som kan avvise xenogeneic eller allogene celler. Osteoporose er indusert i unge rotter gjennom ovariectomy (OVX) og 4 måneder av en LCD. Den unge alderen av OVX rotter, kombinert med LCD tillatt, oss å nå en stille beinmasse, etterligne postmenopausal osteoporose av ledende irreversibel bentap. Dette kan forklares delvis av at, under LCD og i nærheten 3 måneder gammel, rotter overgangen fra benet modellering til remodeling fase ved det lumbal ryggvirvlene33, og dermed øke sannsynligheten for å opprettholde osteoporose over tid. Bruke små dyr gjør denne modellen mer kostnadseffektivt, som de koster mindre. Likevel, det er begrenset av iboende ikke regnskap for biologiske endringer i aldring dyret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporose er mest utbredte årsaken til ryggvirvel kompresjon brudd skyldes en økt belastning på ryggraden og som resulterer i sammenbruddet av ryggvirvel kroppen. Men, er det praktisk talt umulig å generere en skade i en gnager som autentisk reproduserer en lignende ryggvirvel kollaps. I stedet opprette forskere et sylindrisk tomrom i midten av ryggvirvel kroppen å etterligne OVCFs16,17,18,19<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen ble støttet av et stipend fra California Institutt for regenerativ medisin (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
Referências
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
