Semiautomated Longitudinal baseados em Microcomputed tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural de um modelo de fratura Vertebral relacionadas com osteoporose rato Nude
Summary
O objetivo do presente protocolo é gerar um modelo de fratura de compressão vertebral osteoporose-relacionados do rato nude que pode ser avaliada no sentido longitudinal na vivo usando uma microcomputed semiautomated baseado em tomografia computadorizada quantitativa análise estrutural.
Abstract
Fraturas por compressão vertebral relacionadas com osteoporose (OVCFs) são uma necessidade comum e clinicamente não satisfeita com o aumento da prevalência, como a população do mundo envelhece. Modelos animais de OVCF são essenciais ao desenvolvimento de estratégias de engenharia de tecido translacional pré-clínicos. Enquanto um número de modelos existe atualmente, este protocolo descreve um método otimizado para induzir defeitos vertebrais altamente reprodutíveis múltiplos em um único rato nude. Uma tomografia computadorizada romance longitudinal semiautomated microcomputed (µCT)-com base quantitativa análise estrutural dos defeitos vertebrais também é detalhado. Brevemente, ratos foram fotografados em vários pontos de tempo no pós-operatório. O exame de dia 1 foi reorientado para uma posição padrão, e um volume padrão de interesse foi definido. Exames subsequentes µCT de cada rato foram registrados automaticamente para a digitalização de dia 1 para que o mesmo volume de interesse foi então analisado para avaliar para formação de osso novo. Esta abordagem versátil pode ser adaptada a uma variedade de outros modelos em análise baseada em imagem longitudinal poderia beneficiar de alinhamento preciso de semiautomated 3D. Tomados em conjunto, este protocolo descreve um sistema facilmente quantificável e facilmente reproduzível para pesquisa de osteoporose e osso. O protocolo sugerido demora 4 meses para induzir a osteoporose em ratos ovariectomizados nus e entre 2,7 e 4 h para gerar, de imagem e analisar dois defeitos vertebrais, dependendo do tamanho do tecido e equipamento.
Introduction
Mais de 200 milhões de pessoas no mundo sofrem de osteoporose1. O patológico subjacente à diminuição de densidade mineral óssea (DMO) e microarquitetura óssea alterada aumentar a fragilidade óssea e, consequentemente, o risco relativo de fratura2. A osteoporose é tão prevalente e prejudiciais à saúde que a OMS definiu uma preocupação de saúde pública. Além disso, como a população do mundo é esperada para a idade, osteoporose deverá tornar-se ainda mais comum.
Fraturas osteoporóticas vertebrais de compressão são as fraturas de fragilidade mais comuns, estimadas em mais de 750.000 por ano nos Estados Unidos. Eles são associados com morbidade significativa e tanto como uma mortalidade de nove vezes maior taxa3. Em ensaios clínicos, actualmente disponíveis intervenções cirúrgicas, tais como Vertebroplastia e kyphoplasty, foram encontradas para ser sem mais eficaz do que uma farsa tratamento4,5, deixando apenas dor de gestão disponível para estes pacientes. Desde tratamentos OVCF atuais são limitados, é imperativo desenvolver um modelo animal que pode se replicar o transtorno6,7,8. Tais modelos animais poderiam facilitar tanto a investigação de métodos de tratamento atual e o desenvolvimento de novas terapias que irá traduzir na prática clínica. Osteoporose tem sido induzida e sustentada em animais modelo através da administração de uma dieta de baixa-cálcio (LCD) em conjunto com o grupo osteopênico1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. para modelar ainda mais a perda óssea associada com OVCFs, defeitos ósseos vertebrais foram estabelecidos em ratos imunocompetentes osteoporóticas 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. Neste trabalho, é apresentado um modelo de defeito vertebral de ratos imunodeprimidos com osteoporose modelado. Este novo modelo pode ser usado para avaliar terapias baseadas em células envolvendo células-tronco derivadas de várias fontes e espécies para a reparação das fraturas desafiadoras, tais como OVCFs.
Imagem de osso é uma parte crucial da avaliação das fraturas e doenças ósseas. Métodos de imagem avançados foram desenvolvidos para a avaliação precisa das alterações estruturais do osso e de estratégias de regeneração25. Entre eles, a imagem de µCT tem emergido como um método não-invasivo, fácil de usar e barato que fornece imagens 3D de alta resolução. Imagem de µCT tem várias vantagens sobre outras modalidades na avaliação de pacientes de osteoporose, pois oferece 3D de alta resolução de osso microarquitetura26 que podem então ser analisados quantitativamente. Este último então pode ser usado para comparar os efeitos terapêuticos dos tratamentos propostos. Com efeito, na vivo imagem µCT é um padrão-ouro para a regeneração do defeito vertebral monitoramento de16,1,27. No entanto, poucas publicações28,29,30,31 têm empregado ferramentas de registo automatizado para minimizar o erro de precisão de µCT, viés de interpolação e usuário-dependência análise baseada em imagem. Recentemente, fomos os primeiros a usar um processo de registo para melhorar a análise da regeneração óssea em um osso padronizada vazio, conforme explicado no presente protocolo32 .
O método descrito aqui pode ser usado para estudar o efeito das terapias celulares romance OVCFs, desimpedido pelo host respostas de células T que podem rejeitar xenogénicas ou alogênico de células. Osteoporose é induzida em ratos jovens através de ovariectomia (OVX) e 4 meses de um LCD. A tenra idade dos ratos OVX, combinado com o LCD, nos permitiu alcançar uma massa óssea de pico baixo, imitando a osteoporose pós-menopausa por levando a perda óssea irreversível. Isto pode ser explicado em parte pelo fato de que, durante o LCD e a cerca de 3 meses de idade, a transição de ratos de modelagem para remodelar o osso fase nas vértebras lombares33, aumentando assim a probabilidade de manutenção a osteoporose está na hora. Usar animais jovens torna este modelo mais custo-eficaz, como custam menos. No entanto, é limitada pela inerentemente não contabilizar as alterações biológicas do animal de envelhecimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A osteoporose é a causa mais prevalente de fraturas de compressão vertebral, causada por um aumento da carga sobre a coluna vertebral e que resultam no colapso do corpo vertebral. No entanto, é praticamente impossível gerar uma lesão em um roedor que autenticamente replica um colapso vertebral semelhante. Em vez disso, os pesquisadores criar um cilíndrico vazio no centro do corpo vertebral para imitar OVCFs16,17,18,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa foi apoiada por uma concessão do Instituto da Califórnia para medicina regenerativa (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate2%scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine0.3mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears – Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 ml | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment | |||
Referências
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