JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Полу автоматизированное продольной Microcomputed томография-основе количественных структурный анализ связанных остеопороза позвоночника переломов модель Обнаженная крыса

Published: September 28, 2017
doi:
10.3791/55928
, , , , ,
1Skeletal Biotech Laboratory,Hebrew University-Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery,Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Orthopedics,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в создавать обнаженной крыса связанных остеопороза позвоночника сжатия перелом модель, которая может быть продольно оцененные в естественных условиях с помощью полу автоматизированное microcomputed томография основе количественных структурного анализа.

Abstract

Остеопороз связанных позвоночного компрессионных переломов (OVCFs) являются общие и клинически неудовлетворенные потребности с увеличением распространенности по мере старения населения мира. Животные модели OVCF имеют важное значение для доклинической разработки стратегий инженерных трансляционная ткани. Хотя в настоящее время существуют ряд моделей, этот протокол описывает оптимизированный метод для стимулирования несколько высокую воспроизводимость позвоночного дефекты в единый обнаженной крыса. Роман продольных полу автоматизированное microcomputed томография (µCT)-на основе количественных структурный анализ дефектов позвоночника также подробно. Кратко крысы были записи образа на несколько пунктов послеоперационное время. День 1 сканирования была переориентирована на стандартное положение, и стандартный объем интерес был определен. Последующие µCT сканирование каждого крысы были автоматически регистрируется для сканирования 1 день так же объем интерес был затем анализируется для оценки формирования новой кости. Этот универсальный подход может быть адаптирована к целый ряд других моделей, где продольного анализа на основе изображений могут воспользоваться точных 3D полу автоматизированное выравнивание. Взятые вместе, этот протокол описывает легко поддающихся количественному измерению и легко воспроизводимые системы для исследований остеопороза и кости. Предлагаемый протокол занимает 4 месяцев, чтобы побудить остеопороза в ню ovariectomized крыс и между 2.7 и 4 h, чтобы генерировать, изображение и проанализировать два позвонка дефектов, в зависимости от размера ткани и оборудования.

Introduction

Более 200 миллионов человек во всем мире страдают от остеопороза1. Лежащие в основе патологического снижение минеральной плотности костной ткани (BMD) и микроархитектуры кости измененных увеличения хрупкости костей и, соответственно, относительный риск переломов2. Остеопороз является настолько распространенным и вредно для здоровья, что ВОЗ определила его основных проблем здравоохранения. Кроме того как население мира ожидается возраста, остеопороз ожидается стать еще более распространенным.

Остеопорозом позвоночного компрессионных переломов являются наиболее распространенными хрупкости переломов, оценивается в более чем 750 000 в год в США. Они связаны с значительным заболеваемости и как много как девять раз выше смертности3. В клинических испытаниях в настоящее время доступны хирургических вмешательствах, например Вертебропластика и кифопластика, оказались не более эффективными, чем Шам лечения4,5, оставляя только боль управления доступны для этих пациентов. Поскольку текущий OVCF лечения ограничены, необходимо разработать модель животных, которые можно реплицировать в расстройство6,,78. Такие животные модели может облегчить расследование текущих методов лечения и развития Роман терапии, которые будут переводить в клиническую практику. Остеопороз индуцированных и выдержаны в модели животных через администрацию диеты низкий кальция (LCD) в сочетании с овариоэктомии1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. для дальнейшего моделирования костной потери, связанные с OVCFs, дефекты позвоночной кости были созданы в остеопорозом иммунокомпетентных крыс 16,,1718,19, 20,–21,–22,–23,–24. В этой работе представлена модель ослабленным крысы с лепной остеопороза позвоночника дефекта. Этот роман модель может использоваться для оценки на основе ячеек терапии с участием стволовые клетки, полученные из различных источников и видов для ремонта сложных переломов, например OVCFs.

Кость изображений является важной частью оценки переломов и костных заболеваний. Для точной оценки структурных костных изменений и стратегии регенерации25были разработаны передовые методы обработки изображений. Среди них µCT изображений появился как неинвазивный, easy-to-use и недорогой метод, который обеспечивает 3D изображения с высоким разрешением. µCT изображений имеет ряд преимуществ над других методов оценки больных остеопорозом, как это предлагает, с высоким разрешением 3D кости микроархитектуры26 , которые затем могут быть количественно проанализированы. Последний может затем использоваться для сравнения терапевтического воздействия предлагаемого лечения. Действительно в естественных условиях µCT изображений является золотым стандартом для позвоночных дефекта регенерации мониторинг1,16,27. Однако несколько публикаций28,29,,3031 использовали автоматизированная регистрация инструменты для сведения к минимуму пользователя зависимость, интерполяции предвзятости и точности ошибка µCT анализ на основе изображений. Недавно мы были первыми, чтобы использовать процедуру регистрации для улучшения анализа костной регенерации в стандартизированных кости недействительным, как описано в этом протоколе32 .

Метод, описанный здесь может использоваться для изучения влияния Роман клеточной терапии для OVCFs, презрев принимающей ответов Т-клеток, которые могут отклонить культивированная или аллогенных клеток. Остеопороз, индуцированной в молодых крыс через овариоэктомии (OVX) и 4 месяца ЖК. Молодой возраст крыс OVX, в сочетании с LCD допускается, нам достичь низкой пика костной массы, подражая постменопаузальный остеопороз, ведущих к необратимым костной потери. Это может быть частично объясняется тот факт, что во время LCD и около 3 месяцев, крысы переход от моделирования к реконструкции кости фазы в поясничных позвонков33, тем самым увеличивая вероятность сохранения остеопороза время. С помощью молодых животных делает эту модель более экономически эффективным, как они стоят меньше. Тем не менее он ограничен по своей сути не учета биологических изменений в старения животного.

Protocol

под протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) от Медицинский центр Седарс-Синай (протокол № 3609) были выполнены все эксперименты на животных. Анестезии вводили для всех изображений и хирургических процедур. Все животные были размещены в с…

Representative Results

Используя этот протокол, можно изображения и количественно регенерации n = 8 моделируется остеопорозом дефектов позвоночника через разные временные точки. Анатомический матч, полученные путем процедуры регистрации позволяет для анализа же VOI во всех точках времени. Э?…

Discussion

Остеопороз является наиболее распространенной причиной позвоночного компрессионных переломов, вызванных повышенной нагрузки на позвоночник и, в результате распада тела позвонка. Однако это практически невозможно для получения травмы в грызун, которое достоверно повторяет аналогич?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования была поддержана грантом от Калифорнийского института для регенеративной медицины (CIRM) (TR2-01780).

Materials

Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate2%scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine0.3mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5cm, 45°Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears – Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 ml TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
  2. . Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
  3. Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
  4. Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
  5. Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
  6. Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
  7. Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, S27-S31 (1992).
  8. Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
  9. Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
  10. Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
  11. Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
  12. Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
  13. Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
  14. Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
  15. Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
  16. Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
  17. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
  18. Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
  19. Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
  20. Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
  21. Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
  22. Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
  23. Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
  24. Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
  25. Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
  26. Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, 9-16 (2008).
  27. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  28. Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
  29. de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
  30. Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
  31. Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
  32. Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
  33. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
  34. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  35. de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
  36. Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
  37. Leary, S., et al. . AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
  38. Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
  39. Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
  40. Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
  41. Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  42. Turner, A. S. Animal models of osteoporosis–necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).

Tags

SemiautomatedLongitudinalMicrocomputed TomographyQuantitative Structural AnalysisNude RatOsteoporosisVertebral Fracture ModelGlial Regenerative MedicineBone RegenerationIn VivoAnesthesiaSurgical ProcedureAbdominal CavityLumbar SpineVertebral Bodies
check_url/pt/55928?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image