Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

Summary

Dette manuskriptet beskriver standardprotokoller for å måle tau hyperphosphorylation, måle tau bindende piskehale som henger, og lokalisering av intracellulær tau etter medikamentelle behandlinger. Disse protokollene kan brukes gjentatte ganger for screening narkotika eller andre forbindelser som mål tau hyperphosphorylation eller microtubule-binding.

Abstract

Microtubule-assosiert protein tau er en neuronal protein som regionaliserer hovedsakelig i axons. Generelt er tau viktig for normal neuronal fungerer fordi det er involvert i microtubule montering og stabilisering. Foruten neurons, er tau uttrykt i menneskelig bryst og prostata, mage, colorectal, pancreatic kreft hvor det viser nesten liknende struktur og har lignende funksjoner som neuronal tau. Hvor mye tau og dens fosforylering kan endre dens funksjon som en stabilisator piskehale som henger, og føre til utvikling av sammenkoblede spiralformede filamenter i forskjellige nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom. Det er viktig å bestemme fosforylering staten tau og egenskapene microtubule-binding. I tillegg er undersøke den intracellulære lokaliseringen av tau viktig i ulike sykdommer. Dette manuskriptet detaljer standard protokoller for å måle tau fosforylering og tau binding til piskehale som henger i tykktarmskreft celler med eller uten curcumin og LiCl behandling. Disse behandlinger kan brukes å stoppe kreft celle spredning og utvikling. Intracellulær lokalisering av tau er undersøkt ved hjelp av immunohistochemistry og AC confocal mikroskopi mens du bruker små mengder av antistoffer. Disse analyser kan brukes gjentatte ganger for screening forbindelser som påvirker tau hyperphosphorylation eller microtubule binding. Romanen therapeutics brukes til ulike tauopathies eller relaterte anticancer agenter kan potensielt være preget bruker disse protokollene.

Introduction

Tau ble opprinnelig identifisert som en varme-stabil microtubule-assosiert protein som var co renset med tubulin¹. Tau uttrykkes utelukkende i høyere eukaryoter^2,3,4. Hovedfunksjonen til tau er å kontrollere microtubule montering^1,5,6. Det bidrar også til av piskehale som henger⁷, axonal transport⁸, endringer i axonal diameter⁹, dannelsen av neuroma polaritet og neurodegeneration¹⁰. Tau fungerer også som en protein stillaset å kontrollere noen signalveier. Rotte hjernen studier tyder på at tau Nevron-spesifikke og at det først og fremst regionaliserer i axons¹¹. Tau er avgjørende for microtubule polymerisasjon og neuronal utvikling, var tau hypotesen for å spille en viktig rolle i axonal utvikling i det sentrale nervesystemet; denne hypotesen ble senere bekreftet av eksperimenter i vitro og vivo . I tillegg til neurons, er tau uttrykt i forskjellige ikke-neuronal celler, inkludert lever, nyre og muskel celler^12,13. Tau er også uttrykt i menneskelig bryst og prostata, colorectal, mage, bukspyttkjertelkreft cellen linjer og vev^{14,15,16,17,18, 19}. tau er også funnet i inkludering kroppen myositt som vridd tubulofilaments i inkludering organer²⁰.

Tau kan bære flere post-translasjonell modifikasjoner. Av alle post-translasjonell modifikasjoner er fosforylering den vanligste. Økt tau fosforylering reduserer sin affinitet for piskehale som henger, endelig destabiliserende cytoskeleton. Åttifem fosforylering nettsteder har blitt beskrevet i tau protein isolert fra menneskelige Alzheimers sykdom hjernen vev. Disse områdene utgjør 53% serine, 41% threonin, og bare 6% tyrosin rester^21,22,23. Tau fosforylering påvirker beliggenheten, funksjon, binding, løselighet og sin mottakelighet for andre post-translasjonell endringer. Også tau fosforylering mer enn vanlig omfanget (eller mettede med fosfat grupper) som kalles hyperphosphorylation som reproduserer strukturelle og funksjonelle egenskaper av Alzheimers²⁴. Tau opprettholder riktig funksjon av axonal piskehale som henger og sikrer normal neuronal fungerer under fysiologiske forhold. Imidlertid mislykkes hyperphosphorylated tau å opprettholde en velorganisert microtubule binding, forårsaker neuronal tap på grunn av microtubule demontering. Normale nivåer av tau fosforylering er nødvendig for riktig tau fungerer, men tau mislykkes å fungere normalt hvis karakteristiske fosforylering nivået endres og det er hyperphosphorylated²⁵. Alzheimers sykdom og noen andre aldersrelaterte nevrodegenerative lidelser, tau blir hyperphosphorylated og danner par spiralformede filamenter og neurofibrillary ledninger^26,27. Dermed er metoder for å bestemme tau fosforylering og microtubule binding viktig.

Tykktarmskreft, en aldrende-assosiert kreft, er tredje mest diagnostisert i tredje fremtredende død-forårsaker kreft for både menn og kvinner²⁸. Colorectal cancer er en av de viktigste død som forårsaker kreft i den vestlige verden²⁹. Fordi både kolorektal kreft og Alzheimers sykdom er forbundet med aldring og begge skjer hovedsakelig i de utviklede landene der folk nyte lignende kostvaner, kan de to sykdommene liksom være korrelert. I tillegg reagere tau-positive og tau-negative kreftceller forskjellig på chemotherapeutic agenter, f.eks, paklitaxel¹⁶.

Curcumin er en av de viktigste derivater av Curcuma longaindisk krydder gurkemeie³⁰. I århundrer har sørasiatiske bestander fortært gurkemeie i kosten på daglig basis. Curcumin brukes til å behandle ulike sykdommer, inkludert tykktarmskreft, Alzheimers sykdom, diabetes, cystic fibrosis, inflammatorisk tarmsykdom, leddgikt, hyperlipidemi, åreforkalkning og iskemisk hjertesykdom^{31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38}. lithium kan også drepe tykktarmskreft celler eller hindre deres spredning³⁹. Litium kan også brukes for behandling av Alzheimers⁴⁰ som det reduserer tau aggregering og hindrer sin hyperphosphorylation som observert i en transgene mus modell^{41,42,43, 44}.

Dette manuskriptet har som mål å: 1) måle totale tau og phospho-tau uttrykk nivåer i behandlet celler. 2) Beskriv en fosfatase analysen for å måle samlede tau fosforylering; 3) undersøke microtubule-binding av tau; og 4) lokalisere tau av AC confocal mikroskopi i tykktarmskreft cellelinjer behandlet med curcumin eller LiCl. Resultatene viser at cellen behandling med curcumin, som er en angivelig bra chemotherapeutic agent for tykktarmskreft, og behandling med LiCl kan redusere uttrykk for både totale tau og fosforylert tau i tykktarmskreft linjer. Disse behandlinger kan også forårsake kjernefysiske translokasjon av tau. Imidlertid uventet mislykkes curcumin å forbedre binding av tau til piskehale som henger.

Protocol

1. forberedelse av reagenser legge 10 µL av (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor løsning, 10 µL (1 x fra 100 x lager) protease hemmer cocktail løsning og 10 µL (1 x fra 100 x lager) av fosfatase hemmer cocktail løsning 1 mL 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer å forberede komplett RIPA lyseringsbuffer. Forberede 10 x generelle tubulin buffer (PEM) buffer. Add 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' – bis – 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) etylenglykol-bi…

Representative Results

Uttrykk for total tau og phospho-tau ble undersøkt etter behandling av celler med ulike konsentrasjoner av curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling av celler med tre forskjellige konsentrasjonen av curcumin redusert tau uttrykk nivåer; men phospho-tau uttrykk økt på behandling med lav konsentrasjon av curcumin, men redusert ved behandling av celler med høyere curcumin konsentrasjoner. Anti-phospho-tau (Ser396) ble brukt for påvisning av phospho-tau. B?…

Discussion

Dette manuskriptet etablert forskjellige fremgangsmåter for betingelser for å oppdage totale tau og fosforylert tau i tykktarmskreft celler behandlet med curcumin og LiCl. For å vurdere samlet fosforylering status for tau i protein prøver, ble en fosfatase analysen beskrevet. Denne analysen kan brukes til å undersøke statusen fosforylering noen protein.

Denne analysen er basert på prinsippet om at fosforylert protein trekk tregere enn tilstanden ikke-fosforylert. Alkalisk fosfatase og a…

Materials

HCT 116 cell	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Store at -20 °C
penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Trypsin-EDTA solution	WelGene	LS 015-01
100 mm dish	Corning	430161
6 well plate	Corning	Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody	abcam	ab19030
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T1912	Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)	Cytoskeleton	MT001	Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide	Sigma	72068
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M2670
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Store at -20 °C
DPBS	WelGene	LB 001-02
Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	Model 500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
PIPES	Sigma	P1851
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906
Molecular Imager	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Store at 4 °C
Protein assay dye reagent	Bio-Rad	500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb	Cell signalling	2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signalling	2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody	abcam	ab109390
EGTA	Sigma	E3889	Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	Store at -20 °C
PMSF	Sigma	P7626	Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Cell Signalling	5870	Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail	Cell Signalling	5871	Store at 4 °C
RIPA Buffer	Sigma	R 0278	Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human	Sigma	T 9950	Store at -20 °C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X – 100	Store at around 25 °C
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody	ThermoFisher	A-11005	Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy	Leica Microsystem	Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Affymetrix	75819
Protein Assay	Bio-Rad	500-0006	Store at 4 °C