Det här protokollet beskriver stabiliseringen av syrehalten i en liten volym av återvunnet buffert och metodologiska aspekter av inspelning aktivitet-beroende synaptisk plasticitet i nedsänkt akut Hippocampus skivor.
Även om experiment på hjärnan skivor har varit i bruk sedan 1951, kvarstår problem som minskar sannolikheten för att uppnå en stabil och framgångsrik analys av synaptisk transmission modulering när du utför potentiella eller intracellulära fältinspelningar. Detta manuskript beskriver metodologiska aspekter som kan vara till hjälp att förbättra experimentella förhållandena för underhåll av akut hjärnskada skivor och för att registrera fält excitatoriska postsynaptiska potentialer i en kommersiellt tillgänglig nedsänkning kammare med ett utflöde-carbogenation enhet. Den utflöde-carbogenation hjälper till att stabilisera syrenivån i experiment som förlitar sig på återvinning av en liten buffert reservoar att förbättra kostnadseffektiviteten av drogen experiment. Dessutom presenterar manuskriptet representativa experiment att undersöka effekterna av olika carbogenation lägen och stimulering paradigm på aktivitet-beroende synaptisk plasticitet av synaptisk transmission.
1951 var första rapporterade akuta hjärnan slice experimenten bedrivs1. 1971, efter framgångsrika in vitro- inspelningar från piriform cortex2,3 och upptäckten att Hippocampus nervceller är sammankopplade tvären längs septotemporal axeln av hippocampus4, en av de första in vitro -inspelningar av hippocampus neuronal aktivitet var uppnådda5. Likheten mellan de neurofysiologiska eller neurostructural parametrarna av nervceller i vivo och in vitro- villkor är fortfarande föremål för någon debatt6, men 1975, Schwartzkroin7 indikerade att den basala egenskaper av nervceller underhålls i vitro och att högfrekvent stimulering (dvs. tetanization) av afferenter i hippocampus bildandet inducerar en långvarig underlättande av synaptic potentialer8. Elektrofysiologiska inspelning av neuronal aktivitet in vitro- kraftigt expanderat studiet av de cellulära mekanismerna av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet9,10, som hade upptäckts i 1973 av Bliss o.a. 11 i i vivo experimenterar med kaniner.
Studien av neuronal aktivitet eller signalering vägar i hjärnan skivor, och särskilt i akuta Hippocampus skivor, är nu ett standardverktyg. Överraskande, har in vitro- försök dock ännu skall standardiseras, vilket framgår av de flera metoder som fortfarande finns för förberedelser och upprätthållande av akut Hippocampus skivor. Reid et al. (1988) 12 recenserade de metodologiska utmaningarna för underhåll av akut hjärnskada skivor i olika typer av slice chambers och val av badningen medium, pH, temperatur och syre nivå. Dessa parametrar är fortfarande svåra att kontrollera i inspelning kammaren på grund av de måttbeställda delarna av in vitro- slice-inspelning uppställningar. Publikationer kan hittas att kanske hjälp att övervinna några av de metodologiska utmaningarna och som beskriver nya typer av nedsänkning slice chambers, såsom en interstitiell 3D microperfusion system13, en kammare med förbättrad laminärt flöde och syre leverera14, ett system med datoriserad temperatur kontroll15och en multi chamber inspelning system16. Eftersom dessa kamrar inte är lätt att bygga, de flesta forskare förlitar sig på kommersiellt tillgängliga slice chambers. Dessa kammare kan monteras på en Mikroskop system, vilket möjliggör kombinationen av elektrofysiologi och fluorescens imaging17,18,19. Eftersom dessa kamrar hålla hjärnan skivor nedsänkt i konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF), behöver en hög flödeshastighet av buffertlösningen underhållas, ökar på bekostnad av drogen ansökan. Därför har vi bildat ett återvinningssystem perfusion med utflöde-carbogenation som ger tillräcklig stabilitet för långsiktiga inspelning av fältet potentialer i en nedsänkning slice kammare med en relativt liten aCSF volym. Dessutom sammanfattat vi hur användningen av detta experimentella carbogenation/perfusion system påverkar resultatet av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet10 och hur hämning av eukaryota elongation factor-2 tyrosinkinashämmare (eEF2K) modulerar synaptic överföring20.
Även om gränssnittet slice chambers uppvisar mer robust synaptic Svaren25,26,27,28, ger nedsänkning chambers ytterligare bekvämlighet för patch-clamp inspelning och fluorescens Imaging. Således har vi beskrivit flera aspekter av potentiella fältinspelningar i akut Hippocampus skivor med hjälp av en kommersiell nedsänkning slice kammare som kan enkelt förlängas till avbildning av fluo…
The authors have nothing to disclose.
WW genomfördes, analyseras, och utformade experiment och skrev manuskriptet. D.X. och C.P. biträtt i figur förberedelse och genomfört experimenten. Detta arbete stöds av NSFC (31320103906) och 111 Project (B16013) att T.B.
Reagents required | |||
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
Tools and materials for dissection | |||
Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
Electrophysiology equipment and materials | |||
Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi,China | HH-1 | |
4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
lens cleaning paper | Kodak | ||
50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |