Summary

In Situ Karakterisering av Shewanella oneidensis MR1 biofilmer av SALVI och ToF-SIMS

Published: August 18, 2017
doi:

Summary

Denna artikel presenterar en metod för att odla en biofilm för i situ time-of-flight sekundära ion masspektrometri för kemiska mappning i dess hydrerade aktiveras med en mikroflödessystem reaktor, systemet för analys vid den flytande vakuum-gränssnitt. Den Shewanella oneidensis herr-1 med grön fluorescens protein användes som modell.

Abstract

Bakteriell biofilm är ytan-associerade samhällen som studeras kraftigt för att förstå deras egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) och deras roller i miljömässiga mikrobiologi. Denna studie beskriver en metod för att odla biofilm fastsättning till systemet för analys vid den flytande vakuum gränssnitt (SALVI) och uppnå i situ kemiska kartläggning av en levande biofilm genom time-of-flight sekundära ion mass spectrometry (ToF-SIMS). Detta görs genom odling av bakterier både utanför och inom SALVI kanal med våra specialiserade setup samt optisk imaging tekniker att upptäcka biofilm närvaro och tjocklek före ToF-SIMS analys. Våra resultat visar de karakteristiska topparna av de Shewanella biofilmen i dess naturliga hydrerad belysa vid dess lokaliserade vatten klustermiljö, liksom EPS fragment, som skiljer sig drastiskt från den samma biofilmen uttorkad tillstånd. Dessa resultat visar genombrott kapacitet SALVI som möjliggör i situ biofilm imaging med ett vakuum-baserade kemiska imaging instrument.

Introduction

Bakteriell biofilm är ytan-associerade samhällen som har utvecklats över tiden som ett försvar för bakterier att överleva olika negativa fysiska och mekaniska stimuli, vari celler är att bifoga och överleva i många möjliga miljöer. 1 , 2 biofilmer undersöks kraftigt och har tillämpningar inom många områden som biomedicin, medicinsk teknik, jordbruk, och industriell forskning och utveckling. 1 , 2 förstå kemiska mappningen av dessa komplexa mikrobiella samhällen, inklusive deras egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) och deras lokala vatten-klustermiljö, är viktigt att få en korrekt och detaljerad skildringen av deras biologiska aktiviteter. 2

Biofilmer finns och växa inom en mycket hydrerad stat. Detta utgör en stor utmaning i att använda vakuum-baserade ytanalys tekniker såsom time-of-flight sekundära ion mass spectrometry (ToF-SIMS) på grund av svårigheten att studera flyktiga vätskor i vakuum. Som ett resultat, begränsats vakuum-baserade ytanalys tekniker nästan uteslutande till studera biofilm prover på endast deras torkat tillstånd. Dock hämmar studera en biofilm i torkat tillstånd korrekt utredning av dess sanna biologiska mikromiljö. Det orsakar ofta drastiska förändringar till EPS integritet och biofilm morfologi, vilket har visats efter jämföra torra biofilm massa spektrala resultat i situ flytande studier. 3 , 4 denna artikel presenterar en lösning för att studera biofilmer inom deras naturliga hydrerad tillstånd genom att anställa användning av vårt System för analys på flytande vakuum gränssnitt (SALVI),5,6 en mikroflödessystem reaktor som innehåller vätska under dess tunna kiselnitrid (SiN) membran i en microchannel gjord av Polydimetylsiloxan (PMDS), vilket ger direkt tillgång till den sekundära ion sond strålen samtidigt bibehålla den strukturella integriteten av flytande matrisen inom ett vakuum kammaren. 7 , 8

S. oneidensis MR-1 muterad uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) valdes som modellorganism för denna biofilm förfarande illustration på grund av dess metaboliska mångsidighet och gemensam användning i miljö- och tillämpad mikrobiologi, som byggde tungt på sin unika förmåga för minskning av metall och extracellulära elektronöverföring. 9 , 10 , 11 dessutom förekomsten av GFP möjliggjorde enkel kontinuerlig biofilm-tjocklek övervakning genom fluorescensmikroskopi, med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) filter. Våra tidigare studier har påvisat detta bakterier som gynnar fastsättning till fönstret synd med i operando fluorescens imaging för biofilm tillväxt till en tjocklek på upp till 100 mikrometer. 4 , 12 medan detta papper kommer endast att diskutera bekräftelse av biofilm’s närvaro genom fluorescensmikroskopi, SALVI är kompatibel med andra optisk imaging metoder såsom super-resolution fluorescens imaging (dvs. strukturerad belysning mikroskopi (SIM)9) och confocal microscopy (CLSM) imaging4för laserscanning). Optisk imaging kan tjäna till att mäta tjockleken biofilm och få en 3D-bild av, en form av biofilmen som det verkar, bekräftar dess tjocklek och dess fastsättning fönstret synd. 9 medan GFP användes i SIMS analysen, S. oneidensis utan GFP användes för tillväxtkurvan, som här bara krävs mätning av optiska densitet och krävde inte någon fluorescerande imaging. Allmänhet, skillnaden mellan GFP taggade och otaggade arter i tillväxtkurvan är obetydlig. Dessutom, medan detta protokoll använder S. oneidensis MR-1 GFP som modellorganism för att beskriva förfarandet, är proceduren avsedd för någon bakteriell stam som kan behövas för odling inom SALVI. Även om, ges kunskap om den bakteriestam som behövs, kan vissa tillväxt villkor såsom tid, temperatur och syre miljön behöva ändras för att rymma stammen av bakterier ska användas. För odlingsmedium använder den här proceduren ”nanotrådar” medium, tryptic soy buljong (TSB) utan dextros och tryptic soy agar (TSA) utan dextros för odling. Sammansättningen av ”nanotrådar” medium har blivit speciellt framtagen för tillväxten och för övervakning av förlängningar av membranet och periplasm av S. oneidensis som verkar ta formen av små trådar och medelstora sammansättning har varit etablerad inom tidigare forskning. 13 , 14

Våra föregående protokoll på in situ flytande ToF-SIMS har illustrerat den förmån som SALVI har att erbjuda för protein immobilisering och fastsättning synd, liksom en detaljerad protokollet om minskning av ToF-SIMS analys och data. 12 i stället för att upprepa data minskning steg, detta papper skall tjäna till att i stället fokusera på den unika strategin för att upprätta och odla biofilmer inom vår SALVI microchannel, liksom imaging stegen att upptäcka biofilm närvaro och tjocklek tidigare ToF-SIMS analys. Medan biofilmer har varit tidigare begränsat till endast torkade prover inom kammaren av vakuum-baserade ytan analytiska tekniker, kan detaljerade EPS och biofilm kemiska kartläggning av levande biofilmer nu erhållas i situ på grund av denna nya kapacitet.

Protocol

1. beredning av material Beredning av Medium slangar Serum flaskor (en behövs per biofilm kultur och tre behövs per tillväxtkurvan) Obs: som nämnts i inledningen, någon tillväxt medium lämpar sig att tillhandahålla de näringsämnen som behövs för stammen av bakterier av intresse kan utnyttjas för detta förfarande; i det här fallet " nanotrådar " media och TSB utan dextros medium användes för tillväxten av S. oneidensis MR-1 GFP. <sup class="xref…

Representative Results

Dessa representativa resultat tjäna för att visa hur den kemiska profilen av den bifogade biofilmen kan identifieras och tolkas, som erhållits genom ToF-SIMS. Efter plottning masspektra från ToF-SIMS datainsamling, belyst kort i avsnittet förfaranden bör peak identifiering utföras för att tilldela varje respektive m/z-värde identiteter. Detta kan göras genom omfattande litteraturstudie på masspektrometri på bakterier och specifika kemiska fragment som förväntas vara närvara…

Discussion

Efter ympning på logg-fas, är det viktigt att testa antalet dagar och temperatur vid vilken biofilmen bör växa innan det är hälsosamt och tjock nog för imaging, som beskrivs i steg 3.1. Proceduren omfattar särskilt odling en S. oneidensis MR1 biofilm i rumstemperatur; men olika rum temperaturer kan påverka tillväxten. Därför är det viktigt att använda optisk imaging för att förstå om biofilmen är redo innan du fortsätter till ToF-SIMS analys. Likaså kräver olika bakteriestammar olika odlingsbetingels…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi är tacksamma till Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) jorden och biologiska vetenskaper (EBD) uppdrag utsäde laboratorium riktad forskning och utveckling (LDRD) fonden för stöd. Instrumental tillträde lämnades genom W. R. Wiley miljömässiga Molecular Sciences laboratorium (EMSL) allmänna användaren förslag. Nationella vetenskapliga användaren är EMSL sponsrad av Office av biologiska och miljömässiga forskning (BER) på PNNL. Författarna tackar Dr. Yuanzhao Ding för bevis läsa manuskriptet och ge värdefull feedback. PNNL drivs av Battelle för DOE under kontrakt DE-AC05-76RL01830.

Materials

ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

Referências

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79 (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. , (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. , (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29 (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. , (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. . Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. , (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9 (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708 (2016).
  13. Hill, E. A. . Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. , (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8 (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the “added value” of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284 (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. . Mass Spectrometry Handbook. , 988 (2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72 (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry–Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136 (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21 (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).
check_url/pt/55944?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

View Video