इन विट्रो Arabidopsis थालियाना में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए बीजांड खेती
Summary
इस पांडुलिपि का वर्णन एक इन विट्रो बीजांड खेती विधि है कि Arabidopsis zygotes और भ्रूण के लाइव सेल इमेजिंग सक्षम बनाता है । इस विधि युग्मनज ध्रुवीकरण के दौरान intracellular गतिशीलता कल्पना और भ्रूण के विकास में सेल भाग्य विनिर्देशन का उपयोग किया जाता है ।
Abstract
सबसे फूल पौधों में, युग्मनज और भ्रूण मां के ऊतकों में गहरे छिपे हुए हैं, और इस तरह यह लंबे समय से कैसे वे गतिशील विकास का एक रहस्य रहा है; उदाहरण के लिए, कैसे युग्मनज शरीर धुरी की स्थापना के लिए ध्रुवों और कैसे भ्रूण अंग गठन के दौरान विभिंन कोशिका भाग्य निर्दिष्ट करता है । इस पांडुलिपि में एक इन विट्रो बीजांड संस्कृति विधि का वर्णन करने के लिए जीने के zygotes और Arabidopsis थालियानाके भ्रूण के विकास के सेल इमेजिंग प्रदर्शन । अनुकूलित खेती माध्यम zygotes या जल्दी भ्रूण उपजाऊ पौधों में विकसित करने के लिए अनुमति देता है । इसे एक पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar सरणी उपकरण के साथ संयोजित करके, बीजांड को उसी स्थिति में तरल माध्यम में रखा जाता है. यह निर्धारण zygotic विभाजन से कई दिनों के लिए एक खुर्दबीन के नीचे एक ही बीजांड का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है स्वर्गीय भ्रूण मंच । परिणामी लाइव-सेल इमेजिंग युग्मनज ध्रुवीकरण की वास्तविक समय गतिशीलता की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह के रूप में परमाणु प्रवासन और cytoskeleton पुनर्व्यवस्था, और यह भी सेल विभाजन समय और सेल भाग्य विनिर्देश भ्रूण patterning के दौरान. इसके अलावा, इस बीजांड खेती प्रणाली को अवरोधक उपचार के साथ संयुक्त किया जा सकता है भ्रूण विकास पर विभिंन कारकों के प्रभाव का विश्लेषण, और लेजर व्यवधान के रूप में ऑप्टिकल जोड़तोड़ के साथ सेल के सेल संचार की भूमिका की जांच के लिए ।
Introduction
एक जीव की बुनियादी शरीर की योजना एक कोशिकीय युग्मनज से विकसित होती है । सबसे फूल पौधों में, zygotic विभाजन एक शिखर और एक बेसल सेल, जो गोली मार और जड़ में विकसित, क्रमशः1उत्पन्न करता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है समझने के लिए कैसे संयंत्र शरीर embryogenesis के दौरान गठन किया है, लेकिन वहां एक प्रभावी उपकरण के लिए सीधे रहने zygotes और भ्रूण की गतिशीलता का निरीक्षण क्योंकि वे फूल में गहरी विकसित नहीं है । कई monocot प्रजातियों में, जैसे मक्का और चावल, एक इन विट्रो निषेचन विधि में2,3स्थापित किया गया है । इस विधि में, अलग शुक्राणु और अंडा कोशिकाओं विद्युत या रासायनिक जुड़े हुए हैं, और उत्पन्न सेल एक उपजाऊ संयंत्र में विकसित कर सकते हैं. हालांकि, dicot संयंत्रों में, वहां कोई नहीं है इन विट्रो निषेचन विधि है कि उचित भ्रूण का उत्पादन कर सकते हैं, शायद क्योंकि गैर के सिंक्रनाइज़ सेल चक्र राज्य के पुरुष और महिला gametes4,5। इसके अलावा भ्रूण-आसपास के टिशू (endosperm) भ्रूण विकास6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
एक मॉडल dicot प्रजातियों में, ए. थालियाना, एक इन विट्रो खेती विधि में पूरे बीजांड, जो भ्रूण और endosperm7दोनों शामिल है पर ध्यान केंद्रित करके विकसित किया गया था । इस प्रणाली को सफलतापूर्वक embryogenesis पर विभिंन रासायनिक रिएजेंट के प्रभाव का विश्लेषण किया गया था, लेकिन यह समय चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह एक कम जीवित रहने की दर है । इसलिए, एक उपंयास इन विट्रो बीजांड खेती प्रणाली के रूप में युग्मनज चरण के रूप में जल्दी शुरू करने के लिए और एक उच्च अनुपात8पर उपजाऊ पौधों का उत्पादन विकसित किया गया था । विभिन्न परीक्षणों के बाद, यह पाया गया कि Nitsch मध्यम और trehalose काफी ओव्यूल्स के जीवित रहने की दर में सुधार हुआ8. इसके अलावा, क्योंकि बीजांड फैलता है के रूप में यह बढ़ता है और इस प्रकार अक्सर माइक्रोस्कोप के प्रेक्षण क्षेत्र से दूर ले जाता है, एक PDMS डिवाइस के लिए मध्यम9में बीजांड को ठीक करने के लिए विकसित किया गया था । PDMS डिवाइस 3-4 दिनों के लिए दीर्घकालिक इमेजिंग सक्षम है, जो एक दिल चरण भ्रूण के लिए एक युग्मनज से विकास का पता लगाने के लिए पर्याप्त है । इस विधि का उपयोग करना, यह न केवल सामान्य परिस्थितियों में, लेकिन यह भी रासायनिक अवरोधक या विभिन्न उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में की उपस्थिति में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण पैटर्न की गतिशीलता कल्पना करने के लिए संभव हो जाता है8,10 ,11.
चित्रा 1: विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों के योजनाबद्ध आरेख Zygotes और बीजांड के माध्यम से भ्रूण कल्पना करते थे ।
Arabidopsis युग्मनज बीजांड में एक भ्रूण में विकसित करता है, जो गहरे अंदर फूल उत्पन्न होता है । इस में इन विट्रो खेती प्रणाली, युग्मनज और भ्रूण बीजांड के माध्यम से मनाया जाता है, और इस प्रकार यह विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों कि अंय बीजांड ऊतकों में व्यक्त नहीं कर रहे है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Protocol
1. इन विट्रो में की तैयारी बीजांड कल्चर मीडियम के लिए तरल माध्यम बना इन विट्रो बीजांड कल्चर (& #34; N5T मीडियम & #34;) युक्त 1x Nitsch बेसल नमक मिश्रण, 5% (w/v) trehalose डाईहाइड्रेट, ०.०५ % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस)-को…
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि का परिचय एक सरल इन विट्रो बीजांड खेती प्रोटोकॉल है कि zygotes और भ्रूण के विकास के रहते सेल इमेजिंग में उपयोग के लिए कुशल है ।
PDMS डिवाइस के डिजाइन भ्रूण मंच के अनुसार अनुकूलन की आवश?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम में माइक्रोस्कोपी नागोया विश्वविद्यालय के परिवर्तनकारी जैव अणुओं (WPI-ITbM) के संस्थान में आयोजित किया गया था और जापान उन्नत संयंत्र विज्ञान नेटवर्क द्वारा समर्थित. यह काम जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (ERATO परियोजना से T.H. और M.U.) और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: एक अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (नग । JP24113514, JP26113710, JP15H05962, और JP15H05955 के लिए M.U., और नग । JP16H06465, JP16H06464 और JP16K21727 के लिए टी. एच.), युवा वैज्ञानिकों के लिए एक अनुदान सहायता (बी, नग । JP24770045 और JP26840093 के लिए M.U.), और एक अनुदान में सहायता के लिए चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान (सं. JP16K14753 for M.U.) ।
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
Referências
- Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. . Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
