In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana
Summary
Este manuscrito describe una en vitro óvulo cultivo método que permite la proyección de imagen de células vivas de Arabidopsis cigotos y embriones. Este método se utiliza para visualizar la dinámica intracelular durante la polarización del cigoto y la especificación de destino celular en el desarrollo de embriones.
Abstract
En la mayoría de las plantas de la floración, el cigoto y el embrión se ocultan profundamente en el tejido de la madre, y así ha sido durante mucho tiempo un misterio de cómo se desarrollan dinámicamente; por ejemplo, cómo el zigoto se polariza para establecer el eje del cuerpo y cómo el embrión especifica diversos sinos de la célula durante la formación de órganos. Este manuscrito describe un en vitro óvulo método de cultivo para realizar la proyección de imagen de células vivas de desarrollo de cigotos y embriones de Arabidopsis thaliana. El medio de cultivo optimizado permite cigotos o embriones tempranos para crecer las plantas fértiles. Combinando con un dispositivo de arreglo microcolumnas de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), el óvulo se lleva a cabo en el medio líquido en la misma posición. Esta fijación es crucial observar el óvulo mismo microscopio durante varios días de la división postcigótica para la última etapa de embrión. La proyección de imagen de células vivas resultante puede utilizarse para controlar la dinámica en tiempo real de la polarización del cigoto, como la migración nuclear y reordenamiento del citoesqueleto y también el momento de la división de célula y especificación de destino celular durante el dibujo de embrión. Además, este sistema de cultivo del óvulo puede combinarse con tratamientos de inhibidor para analizar los efectos de diversos factores en el desarrollo del embrión y con manipulaciones ópticas como interrupción del láser para examinar el papel de la comunicación de la célula.
Introduction
El plan básico del cuerpo de un organismo se desarrolla a partir de un cigoto unicelular. En la mayoría de las plantas de la floración, división postcigótica genera un apical y una célula basal, que se desarrollan en el brote y la raíz, respectivamente1. Por lo tanto, es importante entender cómo el cuerpo de la planta se forma durante la embriogénesis, pero no ha sido una herramienta efectiva para observar directamente la dinámica de vida cigotos y embriones porque se desarrollan profundamente en la flor. En varias especies de monocotiledóneas, como el maíz y arroz, un método de fertilización en vitro ha sido establecido2,3. En este método, aislada esperma y óvulos se fusionan químicamente o eléctricamente, y la célula generada puede convertirse en una planta fértil. Sin embargo, en las plantas dicotiledóneas, no existe ningún método en vitro fecundación que puede producir embriones adecuados, probablemente debido al estado del ciclo celular asíncrono de gametos masculinos y femeninos4,5. Además, el tejido que rodea el embrión (endospermo) juega un papel importante en el embrión de desarrollo6.
En una especie de dicotiledóneas de modelo, de a. thaliana, fue desarrollado un método de cultivo en vitro concentrándose en el óvulo todo, que contiene el embrión y el endospermo7. Este sistema fue utilizado con éxito para analizar los efectos de diversos reactivos químicos en embriogénesis, pero no es conveniente para Time-lapse de imágenes ya que tiene una baja tasa de supervivencia. Por lo tanto, se desarrolló un sistema de cultivo novedoso en vitro óvulo para iniciar tan pronto como la etapa de cigoto y producir plantas fértiles en un alto cociente8. Después de diversas pruebas, se encontró medio Nitsch y trehalosa mejoró significativamente la tasa de supervivencia de óvulos8. Además, porque el óvulo se expande a medida que crece y por lo tanto con frecuencia se mueve lejos del campo de observación del microscopio, se desarrolló un dispositivo PDMS para arreglar el óvulo en el medio9. El dispositivo PDMS permitió la proyección de imagen a largo plazo de 3-4 días, que es suficiente para trazar el desarrollo de un cigoto a un embrión de corazón-etapa. Usando este método, es posible visualizar la dinámica de la polarización del cigoto y embrión patrones, no sólo en condiciones normales, pero también en presencia de inhibidores químicos o en varios fondos mutante8,10 ,11.
Figura 1: Diagrama esquemático de los marcadores fluorescentes específicos utilizado para visualizar cigotos y embriones a través del óvulo.
El zigoto de Arabidopsis se convierte en un embrión en el óvulo, que se genera en la flor. En este sistema de cultivo in vitro , el cigoto y el embrión se observan a través del óvulo, y por lo tanto es importante utilizar marcadores fluorescentes específicos que no se expresan en otros tejidos del óvulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito presenta un simple en vitro óvulo cultivo protocolo eficiente para el uso en la proyección de imagen de células vivas de desarrollo de cigotos y embriones.
El diseño del dispositivo PDMS puede necesitar optimización según la etapa de embrión. El primer dispositivo desarrollado era una matriz de microcage para ajustar la orientación y para fijar la posición de los óvulos9, y luego fue construido un dispositivo microcolumnas para atrapar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microscopía en este trabajo se llevó a cabo en el Instituto de transformación biomoléculas (WPI-ITbM) de la Universidad de Nagoya y apoyado por la red de la ciencia de planta avanzada de Japón. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Japón Agencia de ciencia y tecnología (proyecto ERATO T.H. y M.U.) y de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia: subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 y JP15H05955 para el M.U. y enmiendas. JP16H06465, JP16H06464 y JP16K21727 de T.H), subvenciones para jóvenes científicos (B, Nos. JP24770045 y JP26840093 para M.U.) y subvenciones para las investigaciones exploratorias desafiante (no. JP16K14753 para M.U.).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
Referências
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