In Vitro Fröämnet odling för Live-cell Imaging av zygot polarisering och Embryo mallning i Arabidopsis thaliana.
Summary
Detta manuskript beskriver en in vitro- fröämnet odlingmetod som gör live-cell avbildning av Arabidopsis zygoter och embryon. Denna metod används för att visualisera den intracellulära dynamiken under zygot polarisering och specifikationen cell öde i utvecklingen av embryon.
Abstract
I de flesta blommande växter, det zygote och embryo är gömda djupt i mor vävnaden, och därmed har det länge varit ett mysterium hur de utvecklas dynamiskt; exempelvis hur zygoten polariserar för att fastställa kropp axeln och hur embryot anger olika cell öden under organ kan bildas. Detta manuskript beskriver en in vitro- fröämnet kultur metod att utföra live-cell imaging att utveckla zygoter och embryon från Arabidopsis thaliana. Det optimera odling mediet tillåter zygoter eller tidiga embryon att växa till bördiga växter. Genom att kombinera det med en poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array enhet, hålls ägget i det flytande mediet i samma position. Denna fixering är avgörande att iaktta samma ägget under ett mikroskop för flera dagar från zygotic avdelningen att sena fosterstadiet. Den resulterande live-cell imaging kan användas för att övervaka i realtid dynamiken i zygot polarisering, såsom kärnkraft migration och cytoskelettet ombildning, och också celldelning tidpunkten och cell öde specifikation under embryo mallning. Detta fröämnet odling system kan dessutom kombineras med hämmare behandlingar att analysera effekterna av olika faktorer på embryots utveckling och med optisk manipulationer såsom laser störningar att undersöka rollen som cell-cell kommunikation.
Introduction
Den grundläggande kropp planen av en organism utvecklas från en encellig zygot. I de flesta blommande växter genererar zygotic division en apikala och en basalcellscancer, som utvecklas till den skjuta och rot, respektive1. Därför är det viktigt att förstå hur växten kroppen bildas under embryogenes, men det har inte varit ett effektivt verktyg att direkt observera dynamiken i levande zygoter och embryon eftersom de utvecklas djupt i blomman. I flera enhjärtbladiga arter, såsom majs och ris, varit en in vitro- fertilisering metod etablerade2,3. I denna metod, isolerade spermier och äggceller är smält elektriskt eller kemiskt, och genererade cellen kan utvecklas till en bördig växt. Dock i Dikotyledon växter finns det ingen in vitro- fertilisering metod som kan producera korrekt embryon, förmodligen på grund av icke-synkroniserade cellcykeln staten av manliga och kvinnliga könsceller4,5. Dessutom spelar den embryo-omgivande vävnaden (frövita) viktiga roller i embryots utveckling6.
I en modell Dikotyledon art, A. thaliana, utvecklades en in vitro- odling metoden genom att fokusera på hela ägget, som innehåller både embryot och frövitan7. Detta system har framgångsrikt använts för att analysera effekterna av olika kemiska reagenser på embryogenes, men det passar inte för time-lapse imaging eftersom den har en låg överlevnad. Därför, en roman i vitro fröämnet odling utvecklades för att börja så tidigt som zygot scenen och producera fertila plantor på en hög andel8. Efter olika prövningar, konstaterades att Nitsch medium och trehalos avsevärt förbättrat överlevnaden av fröämnen8. Dessutom eftersom ägget expanderar när den växer och därmed ofta rör sig bort från fältet observation av Mikroskop, utvecklades en PDMS-enhet för att fixa ägget i medium9. PDMS enheten aktiverad av långsiktiga imaging för 3-4 dagar, vilket är tillräckligt för att spåra utvecklingen från en zygot till ett hjärta-scenen embryo. Med den här metoden blir det möjligt att visualisera dynamiken i zygot polarisering och embryo mönstring, inte bara under normala förhållanden, men också i närvaro av kemiska hämmare eller i olika muterade bakgrunder8,10 ,11.
Figur 1: Schematisk bild av de specifika fluorescerande markörer används för att visualisera zygoter och embryon genom the fröämnet.
Arabidopsis zygoten utvecklas till ett embryo i ägget, som genereras djupt inne i blomman. Det zygote och embryo observeras genom ägget i in vitro- odling systemet, och därför är det viktigt att använda specifika fluorescerande markörer som inte uttrycks i andra fröämnet vävnader. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript introducerar ett enkelt in vitro- fröämnet odling protokoll som är effektiv för användning i av live-cell imaging att utveckla zygoter och embryon.
Utformningen av PDMS enheten behöva optimering enligt embryostadiet. Den första utveckla enheten var en microcage matris Justera orienteringen och fixar ståndpunkten av fröämnen9, och sedan en micropillar enhet konstruerades för att fälla fröämnen effektivare8. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mikroskopi i detta arbete utfördes på institutet av omvälvande Bio-molekyler (WPI-ITbM) Nagoya University och stöds av Japan avancerade Plant Science nätverket. Detta arbete stöds av bidrag från Japan Science och Technology Agency (ERATO projekt att T.H. och M.U.) och från Japan Society för främjande av vetenskap: ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 och JP15H05955 för M.U. och Nos. JP16H06465, JP16H06464 och JP16K21727 för T.H), ett bidrag för unga forskare (B, Nos. JP24770045 och JP26840093 för M.U.), och ett bidrag för utmanande utforskande forskning (nr. JP16K14753 för M.U.).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
Referências
- Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. . Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
