Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Summary

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Abstract

Der menschliche Knorpelknorpel fehlt die Fähigkeit, sich selbst zu reparieren. Knorpeldegeneration wird also nicht durch kurative, sondern durch konservative Behandlungen behandelt. Derzeit werden Anstrengungen unternommen, um beschädigten Knorpel mit ex vivo expandierten Chondrozyten oder Knochenmark-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) zu regenerieren. Die eingeschränkte Lebensfähigkeit und Instabilität dieser Zellen begrenzen jedoch ihre Anwendung bei der Knorpelrekonstruktion. Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) haben wissenschaftliche Aufmerksamkeit als neue Alternative für regenerative Anwendungen erhalten. Mit unbegrenzter Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz wurden hiPSCs als neue Ersatzzellenquelle für die Knorpelreparatur hervorgehoben. Allerdings ist die Erlangung einer hohen Menge an hochwertigen chondrogenen Pellets eine große Herausforderung für ihre klinische Anwendung. In dieser Studie verwendeten wir Embryoidkörper (EB) -geleitete Auswuchszellen für die chondrogene Differenzierung. Die erfolgreiche Chondrogenese wurde durch PCR undD-Färbung mit alcianblauem, Toluidinblau und Antikörpern gegen Kollagenarten I und II (COL1A1 bzw. COL2A1). Wir bieten eine detaillierte Methode zur Differenzierung von Nervenblutmononukleären Zellen-abgeleiteten iPSCs (CBMC-hiPSCs) in chondrogene Pellets.

Introduction

Die Verwendung von hiPSCs stellt eine neue Strategie für Arzneimittel-Screening und mechanistische Studien verschiedener Krankheiten dar. Aus einer regenerativen Perspektive sind hiPSCs auch eine potentielle Quelle für den Ersatz von beschädigten Geweben, die eine begrenzte Heilfähigkeit aufweisen, wie z.B. Gelenkknorpel ^{1 , 2} .

Die Regeneration des nativen Knorpelknorpels ist seit Jahrzehnten eine Herausforderung. Gelenkknorpel ist ein weiches, weißes Gewebe, das das Ende der Knochen beschichtet und sie vor Reibung schützt. Allerdings hat es begrenzte regenerative Fähigkeit, wenn beschädigt, die Selbst-Reparatur fast unmöglich macht. Daher ist die Forschung über die Knorpelregeneration seit mehreren Jahrzehnten im Gange.

Bisher wurde in vitro die Differenzierung in die chondrogene Linie üblicherweise mit BMSCs oder nativen Chondrozyten durchgeführt, die aus dem Kniegelenk isoliert wurden ³ . Fällig tO ihr chondrogenes Potenzial, BMSCs und native Chondrozyten haben zahlreiche Verdienste, die ihre Verwendung in der Chondrogenese unterstützen. Wegen ihrer begrenzten Ausdehnung und ihres instabilen Phänotyps stehen diese Zellen jedoch vor einer Einschränkung bei der Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten. Unter in vitro- Kulturbedingungen neigen diese Zellen dazu, ihre eigenen Eigenschaften nach 3-4 Passagen zu verlieren, was schließlich ihre Differenzierungsfähigkeit beeinflusst ⁴ . Auch bei nativen Chondrozyten ist bei der Gewinnung dieser Zellen eine zusätzliche Schädigung des Kniegelenks unvermeidlich.

Im Gegensatz zu BMSCs oder nativen Chondrozyten können sich hiPSCs in vitro unendlich erweitern. Mit den richtigen Kulturbedingungen haben hiPSCs ein großes Potenzial als Ersatzquelle für die chondrogene Differenzierung. Allerdings ist es schwierig, die intrinsischen Eigenschaften von hiPSCs ⁵ zu ändern. Darüber hinaus dauert es mehrere komplizierte in vitro stePs, um das Schicksal von hiPSCs auf einen bestimmten Zelltyp zu lenken. Trotz dieser Komplikationen wird die Verwendung von hiPSCs aufgrund ihrer hohen Selbsterneuerungsfähigkeiten und ihrer Fähigkeit, in zielgerichtete Zellen, einschließlich Chondrozyten, zu differenzieren, noch empfohlen.

Die chondrogene Differenzierung erfolgt üblicherweise mit dreidimensionalen Kultursystemen wie der Pelletkultur oder der Mikromassenkultur unter Verwendung von MSC-ähnlichen Progenitorzellen. Bei der Verwendung von hiPSCs unterscheidet sich das Protokoll zur Erstellung von MSC-ähnlichen Progenitorzellen von den vorhandenen Protokollen. Einige Gruppen verwenden eine Monolayer-Kultur von hiPSCs, um den Phänotyp direkt in MSC-ähnliche Zellen umzuwandeln ⁷ . Allerdings verwenden die meisten Studien EBs, um Auswuchszellen zu erzeugen, die den MSCs ^{8 , 9 , 10 , 11} ähneln.

Verschiedene Arten von Wachstumsfaktoren werden verwendet, um Chondroge zu induzierenNesis Normalerweise werden BMP- und TGF & bgr; -Familie-Proteine ​​allein oder in Kombination verwendet. Die Differenzierung wurde auch mit anderen Faktoren wie GDF5, FGF2 und IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} induziert. Es wurde gezeigt, dass TGFβ1 die Chondrogenese dosisabhängig in MSCs ¹⁶ stimuliert. Im Vergleich zum anderen Isotyp induziert TGF & bgr; 3, TGF & bgr; 1 die Chondrogenese durch Erhöhung der Mortochymal-Zellkondensation vor dem Knorpel. TGF & bgr; 3 induziert die Chondrogenese durch signifikante Erhöhung der mesenchymalen Zellproliferation ¹⁷ . Allerdings wird TGFβ3 häufiger von Forschern als TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} verwendet. BMP2 verstärkt die Expression von Genen, die mit den chondrogenen Matrixkomponenten im Menschen zusammenhängenArtikuläre Chondrozyten unter in vitro Bedingungen ²⁰ . BMP2 erhöht die Expression von Genen, die für die Knorpelbildung in MSCs in Kombination mit TGFβ-Proteinen kritisch sind. Es wurde auch gezeigt, dass BMP2 die Wirkung von TGF & bgr; 3 durch die Smad- und MAPK-Wege ²² synergistisch verstärkt.

In dieser Studie wurden CBMC-hiPSCs in EBs unter Verwendung von EB-Medium in einer Petrischale mit geringer Anlagerung aggregiert. Auswuchszellen wurden durch Anbringen der EBs an eine mit Gelatine beschichtete Schale induziert. Die chondrogene Differenzierung unter Verwendung von Auswuchszellen wurde durch Pelletkultur durchgeführt. Die Behandlung mit sowohl BMP2 als auch TGFβ3 kondensierte erfolgreich die Zellen und induzierte extrazelluläre Matrix (ECM) Protein-Akkumulation für die chondrogene Pelletbildung. Diese Studie schlägt ein einfaches, aber effizientes chondrogenes Differenzierungsprotokoll unter Verwendung von CBMC-hiPSCs vor.

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss der katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt. CBMCs, die für die Umprogrammierung verwendet wurden, wurden direkt von der Cord Blood Bank des Seoul St. Mary's Hospital erhalten. 1. Chondrogene Differenzierung von iPSCs CBMC-iPSC Generation Generiere CBMC-hiPSCs mit dem in unserer vorherigen Arbeit gezeigten Protokoll 23 . Sammle d…

Representative Results

In dieser Studie erzeugten wir chondrogene Pellets aus CBMC-hiPSCs, indem sie Auswuchszellen aus EBs induzierten. Die chondrogene Differenzierung wurde mit CBMC-hiPSCs mit bestätigter hoher Pluripotenz induziert 11 . Ein einfaches Schema unseres Protokolls ist in Fig. 1A gezeigt . Vor der Differenzierung wurden iPSC-Kolonien erweitert (Abbildung 1B ). Die erweiterten iPSCs wurden als EBs zusammengesetzt,…

Discussion

Dieses Protokoll hat erfolgreich HIPSCs von CBMCs generiert. Wir programmierten CBMCs zu hiPSCs unter Verwendung eines Sendai Virusvektors, der Yamanaka Faktoren enthält ²⁴ . Drei Fälle wurden in der Differenzierung verwendet, und alle Experimente erzeugten erfolgreich chondrogene Pellets unter Verwendung dieses Protokolls. Zahlreiche Studien haben Protokolle für die Differenzierung von hiPSCs in Chondrozyten ^{25 , 26 ,} <sup …

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40μg/ml)