Formação de grânulos condrogénicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por sangue do cordão umbilical

Resumo

Aqui, propomos um protocolo para a diferenciação condrogênica das células-tronco pluripotentes induzidas por células derivadas de células mononucleares do sangue do cordão umbilical.

Resumo

A cartilagem articular humana não possui a capacidade de se reparar. A degeneração da cartilagem é assim tratada não por curativo, mas por tratamentos conservadores. Atualmente, estão sendo feitos esforços para regenerar a cartilagem danificada com condrócitos expandidos ex vivo ou células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea (BMSCs). No entanto, a viabilidade restrita e a instabilidade destas células limitam a sua aplicação na reconstrução da cartilagem. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) receberam atenção científica como uma nova alternativa para aplicações regenerativas. Com capacidade de auto-renovação ilimitada e multipotência, os hiPSCs foram destacados como uma nova fonte celular de substituição para o reparo da cartilagem. No entanto, a obtenção de uma grande quantidade de grânulos condrogénicos de alta qualidade é um desafio importante para a sua aplicação clínica. Neste estudo, utilizamos células de crescimento indireto do corpo embrionário (EB) para diferenciação condrogênica. A condrogênese bem sucedida foi confirmada por PCR eD coloração com azul alciano, azul de toluidina e anticorpos contra os tipos de colágeno I e II (COL1A1 e COL2A1, respectivamente). Nós fornecemos um método detalhado para a diferenciação de iPSCs derivadas de células mononucleares de sangue do cordão umbilical (CBMC-hiPSCs) em pellets condrogênicos.

Introdução

O uso de hiPSCs representa uma nova estratégia para rastreamento de drogas e estudos mecanicistas de várias doenças. Do ponto de vista regenerativo, os hiPSCs também são uma fonte potencial para a substituição de tecidos danificados que têm capacidade de cura limitada, como a cartilagem articular ^{1 , 2} .

A regeneração da cartilagem articular nativa tem sido um desafio há várias décadas. A cartilagem articular é um tecido macio e branco que abaixa a extremidade dos ossos, protegendo-os da fricção. No entanto, tem habilidade regenerativa limitada quando danificada, o que torna o aut....

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861). Os CBMCs utilizados para a reprogramação foram obtidos diretamente do Cord Blood Bank do Seoul St. Mary's Hospital.

1. Diferenciação condrogênica de iPSCs

1. Geração CBMC-iPSC
   1. Gerar CBMC-hiPSCs usando o protocolo mostrado em nosso trabalho anterior ²³ .
   2. Colecione as células sanguíneas em um tubo cônico de 15 mL e conte-as usando um hemocitômetro.
   3. Prepare 3 x 10 ⁵ células e centrifugá-las por 5 minutos a 515 xg e RT. Descarte o sobr....

Resultados

Neste estudo, geramos grânulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs induzindo células de crescimento de EBs. A diferenciação condrogênica foi induzida usando CBMC-hiPSCs com alta pluripotência confirmada ¹¹ . Um esquema simples de nosso protocolo é mostrado na Figura 1A . Antes da diferenciação, as colônias iPSC foram expandidas ( Figura 1B ). Os iPSC expandidos foram montados como EBs para iniciar a diferenciaçã.......

Discussão

Este protocolo gerou com êxito hiPSCs de CBMCs. Nós reprogramamos CBMCs para HiPSCs usando um vetor viral Sendai contendo fatores Yamanaka ²⁴ . Três casos foram utilizados na diferenciação, e todas as experiências geraram com sucesso grânulos condrogénicos usando este protocolo. Numerosos estudos relataram protocolos para a diferenciação de hiPSCs em condrócitos ^{25 , 26 , 27 ,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plásticos
100 mm Prato	TPP	93100
Placa de 6 poços	TPP	92006
Tubo Cornical de 50 mL	SPL	50050
Tubo Cornical de 15 mL	SPL	50015
Pipeta Descartável de 10 mL	Falcon	7551
5 mL Pipeta descartável	Falcon	7543
Placa de 12 poços	TPP	92012
Nome	Empresa	Número de catálogo	Descrição
E8 Materiais médios
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Médio (500 mL)
Bicarbonato de Sódio	Life Technologies	25080-094	E8 Médio (Conc.: 543 μ g/mL)
Selenito de Sódio	Sigma Aldrich	S5261	E8 Médio  (Conc.: 14 ng/mL)
Meio Transfferin Sigma	Aldrich	T3705	E8 Humano (Conc.: 10.7 μ g/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Médio (Conc.: 20 μ g/mL)
TGF humanoβ 1	Peprotech	100-21	E8 Médio (Conc.: 2 ng/mL)
Ácido Ascórbico	Sigma Aldrich	A8960	E8 Médio  (Conc.: 64 μ g/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectina	Life Technologies	A14700
Inibidor de ROCK	Sigma Aldrich	Y0503
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Descrição
< forte> materiais de controle de qualidade< / forte>
18 mm Vidro de cobertura	superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Inovação	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
de vetor	albumina de soro bovino	SP-5050
Anticorpo anti-SSEA4	Millipore	MAB4304
Anticorpo anti-Oct4	Santa Cruz	SC9081
Anticorpo anti-TRA-1-60	Millipore	MAB4360
Anticorpo anti-Sox2	Biolegend	630801
Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 anticorpo IgG (H+L) de cabra Ponta	prova molecular	A11029
Alexa Fluor 594 anticorpo IgG (H+L) de cabra anti-coelho	Sonda molecular	A11037
ponta de prova molecular	D1306		DAPI
prolonga a	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	do ouro & Inovação	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
de Vetor	Albumina de Soro Bovino	SP-5050
Anti-Colágeno II	anticorpo abcam	ab34712	1:100
Alcian azul	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma	Aldrich F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear vermelho rápido	Americanmastertech	STNFR100
xileno	Duksan	115
Etanol	Duksan	64-17-5
Solução de hematoxilina de Mayer	Indústrias químicas puras wako	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Vidro da corrediça, revestido	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Clorofórmio	Sigma Aldrich	366919
Álcool Isopripílico	Millipore	109634
Etanol	Duksan	64-17-5
Kit de Síntese de cDNA de Fita RevertAid First Strand	Thermo Scientfic	K1622
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo	Descrição
Materiais de diferenciação condrogênica
DMEM	Life Technologies	11885	Componente de mídia condrogênica (500 mL)
Penicilina Estreptomicina	Life Technologies	P4333	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)
Ácido ascórbico	Sigma Aldrich	A8960	Componente de meio condrogênico (Conc.: 64 μ g/mL)
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100x)	Life Technologies	11140-050	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R& D	355-BM-050	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 100 ng / ml)
Hman TGF-beta3 recombinante	R & D	243-B3-002	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 10 ng / ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)
ITS+ Premix	BD	354352	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)
Dexametasona-Solúvel em água	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Componente de mídia condrogênica (Conc.:10-7 M)
Suplemento GlutaMAX	Life Technologies	35050-061	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)
Solução de piruvato de sódio	Sigma Aldrich	S8636	Componente de mídia condrogênica (Conc.: 1%)
L-Prolina	Sigma Aldrich	P5607-25G	Mídia condrogênica componente (40 μ g/ml)

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