Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Summary

Aquí, proponemos un protocolo para la diferenciación condrogénica de células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células mononucleares de sangre del cordón umbilical.

Abstract

El cartílago articular humano carece de la capacidad de repararse. Por lo tanto, la degeneración del cartílago no se trata por tratamientos curativos sino por tratamientos conservadores. Actualmente, se están haciendo esfuerzos para regenerar el cartílago dañado con condrocitos expandidos ex vivo o células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BMSCs). Sin embargo, la viabilidad limitada y la inestabilidad de estas células limitan su aplicación en la reconstrucción del cartílago. Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSCs) han recibido atención científica como una nueva alternativa para aplicaciones regenerativas. Con ilimitada capacidad de auto-renovación y multipotencia, HiPSCs se han destacado como una nueva fuente de células de reemplazo para la reparación del cartílago. Sin embargo, la obtención de una gran cantidad de gránulos condrogénicos de alta calidad es un reto importante para su aplicación clínica. En este estudio, se utilizó el cuerpo embrioide (EB) derivado de las células de crecimiento para la diferenciación condrogénica. La condrogénesis exitosa fue confirmada por PCR yD con azul alciano, azul de toluidina y anticuerpos contra los tipos de colágeno I y II (COL1A1 y COL2A1, respectivamente). Proporcionamos un método detallado para la diferenciación de células madre mononucleares derivadas de células madre ipSCs (CBMC-hiPSCs) en chondrogenic pellets.

Introduction

El uso de hiPSCs representa una nueva estrategia para la detección de drogas y estudios mecánicos de diversas enfermedades. Desde una perspectiva regenerativa, hiPSCs son también una fuente potencial para la sustitución de los tejidos dañados que tienen capacidad de curación limitada, como el cartílago articular ^{1 , 2} .

La regeneración del cartílago articular nativo ha sido un reto durante varias décadas. El cartílago articular es un tejido suave y blanco que recubre el extremo de los huesos, protegiéndolos de la fricción. Sin embargo, tiene una capacidad regenerativa limitada cuando está dañada, lo que hace que la auto-reparación sea casi imposible. Por lo tanto, la investigación centrada en la regeneración del cartílago ha estado en curso durante varias décadas.

Anteriormente, la diferenciación in vitro en el linaje condrogénico se realizó generalmente con BMSCs o condrocitos nativos aislados de la articulación de la rodilla [ ^3] . Debido tO su potencial condrogénico, las BMSC y los condrocitos nativos tienen numerosos méritos que apoyan su uso en la condrogénesis. Sin embargo, debido a su limitada expansión y fenotipo inestable, estas células enfrentan varias limitaciones en la reconstrucción de los defectos del cartílago articular. Bajo condiciones de cultivo in vitro , estas células tienden a perder sus propias características después de 3-4 pases, lo que finalmente afecta a sus capacidades de diferenciación [ ^4] . Además, en el caso de condrocitos nativos, un daño adicional a la articulación de la rodilla es inevitable cuando se obtienen estas células.

A diferencia de BMSCs o condrocitos nativos, hiPSCs puede expandirse indefinidamente in vitro . Con las condiciones de cultivo adecuadas, los hiPSC tienen un gran potencial como fuente de reemplazo para la diferenciación condrogénica. Sin embargo, es un desafío para cambiar las características intrínsecas de hiPSCs [ ^5] . Por otra parte, se necesitan varias complicaciones in vitroPs para dirigir el destino de hiPSCs a un tipo de célula específico. A pesar de estas complicaciones, el uso de los hiPSCs sigue siendo recomendable debido a su alta capacidad de auto-renovación y su capacidad para diferenciarse en las células objetivo, incluidos los condrocitos [ ^6] .

La diferenciación condrogénica se realiza habitualmente con sistemas de cultivo tridimensionales, tales como el cultivo de pellets o el cultivo de micromasas, utilizando células progenitoras similares a MSC. Si se usan hiPSCs, el protocolo para generar células progenitoras tipo MSC difiere de los protocolos existentes. Algunos grupos utilizan cultura monocapa de hiPSCs para convertir directamente el fenotipo en MSC-como las células [ ^7] . Sin embargo, la mayoría de los estudios utilizan EBs para generar células de crecimiento que se asemejan a MSCs ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Se utilizan diversos tipos de factores de crecimiento para inducir el condrogeNesis Normalmente, las proteínas de la familia BMP y TGFβ se usan, solas o en combinación. La diferenciación también se ha inducido con otros factores, tales como GDF5, FGF2, y IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . Se ha demostrado que TGFβ1 estimula la condrogénesis de una manera dependiente de la dosis en MSCs ¹⁶ . Comparado con el otro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce condrogenesis mediante el aumento de la condensación de células mesenquimales pre-cartilage.TGFβ3 induce condrogenesis mediante el aumento significativo de la proliferación de células mesenquimales [ ^17] . Sin embargo, TGFβ3 es utilizado con mayor frecuencia por los investigadores que TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 mejora la expresión de genes relacionados con los componentes de la matriz condrogénica en humanosCondrocitos articulares bajo condiciones in vitro ²⁰ . BMP2 aumenta la expresión de genes críticos para la formación de cartílago en MSCs en combinación con TGF β proteínas [ ^21] . También se ha demostrado que BMP2 sinérgicamente mejora el efecto de TGF β3 a través de las vías Smad y MAPK [ ^22] .

En este estudio, CBMC-hiPSCs se agregaron en EBs utilizando medio EB en una placa de Petri de baja fijación. Las células de crecimiento se indujeron uniendo los EB a un plato recubierto de gelatina. La diferenciación condrogénica utilizando células de crecimiento se realizó por cultivo de pellets. El tratamiento con BMP2 y TGFβ3 condensó con éxito las células y indujo la acumulación de proteínas de la matriz extracelular (ECM) para la formación de gránulos condrogénicos. Este estudio sugiere un sencillo pero eficiente clondrogenic diferenciación protocolo utilizando CBMC-hiPSCs.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861). CBMCs utilizados para la reprogramación se obtuvieron directamente del Banco de Sangre de Cordón del Hospital St. Mary de Seúl. 1. Diferenciación condrogénica de iPSCs Generación CBMC-iPSC Generar CBMC-hiPSCs utilizando el protocolo mostrado en nuestro trabajo anterior 23 . Recoja las células de …

Representative Results

En este estudio, hemos generado gránulos condrogénicos de CBMC-hiPSCs por inducir las células de extracción de EBs. La diferenciación condrogénica se indujo utilizando CBMC-HiPSCs con confirmada alta pluripotencia [ 11] . Un esquema simple de nuestro protocolo se muestra en la Figura 1A . Antes de la diferenciación, las colonias de iPSC se expandieron ( Figura 1B ). Los iPSCs ampliado se ensamblaro…

Discussion

Este protocolo generó con éxito HiPSCs de CBMCs. Se reprogramaron CBMCs a hiPSCs utilizando un vector viral Sendai que contiene Yamanaka factores [ ^24] . Tres casos se utilizaron en la diferenciación, y todos los experimentos generados con éxito chondrogenic pellets utilizando este protocolo. Numerosos estudios han informado de protocolos para la diferenciación de hiPSCs en condrocitos ^{25 , 26 , 27} …

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40μg/ml)