एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी
Summary
हम एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके यांत्रिक संपत्तियों और एकल प्रोटीन अणुओं के यांत्रिक खुलासा मार्ग को मापने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं और रणनीतियों का वर्णन करते हैं । हम भी एक अच्छा एकल प्रोटीन अणु रिकॉर्डिंग के चयन और औचित्य के लिए एक संदर्भ के रूप में प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं ।
Abstract
उनके एमिनो एसिड अनुक्रम से उनके मूल 3d संरचना करने के लिए प्रोटीन की तह प्रक्रिया का निर्धारण जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण समस्या है. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (afm) खींच और एक प्रोटीन अणुओं की छूट को सक्षम करने के द्वारा इस समस्या का समाधान कर सकते हैं, जो विशिष्ट खुलासा और refolding विशेषताओं का प्रत्यक्ष सबूत देता है । afm आधारित एकल अणु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी (afm-smfs) लगातार पारंपरिक थोक (जैव रासायनिक) माप में संभव नहीं हैं कि प्रोटीन में उच्च ऊर्जा conformations को मापने के लिए एक साधन प्रदान करता है. हालांकि कई कागजात afm-smfs के सिद्धांतों को दिखाने के लिए प्रकाशित किया गया था, यह आसान नहीं है एक विस्तृत पूर्ण प्रोटोकॉल की कमी के कारण smfs प्रयोगों आचरण. इस अध्ययन में, हम संक्षेप में afm के सिद्धांतों का वर्णन और बड़े पैमाने पर विस्तार प्रोटोकॉल, प्रक्रियाओं, और एक दिशानिर्देश के रूप में डेटा विश्लेषण smfs प्रयोगों से अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए. हम प्रतिनिधि smfs एकल प्रोटीन यांत्रिक खुलासा माप के परिणामों का प्रदर्शन और हम कुछ आमतौर पर समस्याओं का सामना करना पड़ा के लिए समस्या निवारण रणनीतियों प्रदान करते हैं ।
Introduction
एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (smfs) में afm द्वारा अग्रिम यांत्रिक हेरफेर और एकल प्रोटीन अणुओं के सटीक लक्षण वर्णन सक्षम है । इस लक्षण वर्णन प्रोटीन यांत्रिकी के बारे में उपन्यास अंतर्दृष्टि का उत्पादन किया है1,2, प्रोटीन तह3, प्रोटीन-ligand बातचीत4, प्रोटीन प्रोटीन बातचीत5, और प्रोटीन आधारित इंजीनियर सामग्री6,7,8. smfs प्रोटीन खुलासा का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, के रूप में afm द्वारा खींच प्रोटीन अणु के भीतर रासायनिक और शारीरिक बांड की अनुमति देता है धीरे से उनके कठोरता के अनुसार विस्तार, जो एक लगातार बढ़ती समोच्च लंबाई को जंम देता है । एक प्रोटीन अणु की यह overstretching बल-विस्तार एक टूटना घटना (या बल चोटी) में जिसके परिणामस्वरूप वक्र में एक अचानक संक्रमण का उत्पादन कर सकते हैं । फोर्स पीक यांत्रिक खुलासा प्रक्रिया के दौरान खुलासा बल और प्रोटीन के संरचनात्मक परिवर्तन पर सीधी जानकारी देता है । पहले अध्ययन में से एक afm मापा titin1 और पाया प्रोटीन के उपंयास पहलुओं को खुलासा और केंद्रित रसायनों या चरम तापमान की तरह अप्राकृतिक denaturants के उपयोग के बिना शारीरिक स्थितियों के तहत refolding ।
smfs प्रयोगों उपकरणों की एक किस्म पर आयोजित कर रहे हैं, हालांकि यहाँ हम केवल afm पर विचार. afm चार मुख्य तत्वों से बना है: जांच, डिटेक्टर, नमूना धारक, और piezoelectric स्कैनर । जांच एक cantilever के मुक्त झूल अंत पर एक तेज टिप है । अंशांकन के बाद, एक संलग्न अणु की खींच के दौरान ब्रैकट के झुकने एक लेजर बीम कि बंद करने के लिए ब्रैकट के पीछे परिलक्षित होता है का उपयोग कर मापा जाता है ठीक है hooke कानून का उपयोग बलों का निर्धारण । परिलक्षित लेजर बीम परियोजनाओं में एक क्वाड्रेंट photodiode डिटेक्टर जो डायोड केंद्र से लेजर बीम के विस्थापन के अनुपात में एक वोल्टेज पैदा करता है. तरल पदार्थ में प्रोटीन नमूना के साथ सब्सट्रेट एक 3 डी piezoelectric मंच है कि उप नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ नियंत्रित किया जा सकता है पर मुहिम शुरू की है । एक कंप्यूटर photodiode डिटेक्टरों से वोल्टेज पढ़ता है और एक कंप्यूटर नियंत्रित वोल्टेज की आपूर्ति के माध्यम से 3 डी चरण को नियंत्रित करता है. इन पीजो actuator चरणों आमतौर पर कपैसिटिव या तनाव गेज स्थिति सेंसर के साथ सुसज्जित कर रहे हैं ठीक पीजो विस्थापन को मापने के लिए और फ़ीड-वापस नियंत्रण प्रणाली के माध्यम से हिस्टेरीसिस सही करने के लिए. पीजो नियंत्रक से सेंसर संकेत उत्पादन कि कारखाना-calibrated है पीजो की वोल्टेज स्थिरांक का उपयोग कर दूरी में कनवर्ट किया जाता है. एक पुलिंग प्रयोग से एक उदाहरण बल-विस्तार वक्र चित्रा 2में दिखाया गया है ।
लगातार वेग और लगातार बल खींच माप: afm-smfs प्रयोगों के दो प्रकार के होते हैं । लगातार बल smfs मापन oberhauser एट अल में वर्णित हैं । 9, जबकि यहां हम लगातार वेग मापन पर ध्यान केंद्रित । एक ठेठ afm लगातार वेग खींच प्रयोग एक पीजो को वोल्टेज प्रदान करने के लिए धीरे से एक ब्रैकट टिप के सापेक्ष एक सब्सट्रेट चाल द्वारा किया जाता है । एक ठेठ प्रयोग टिप शुरू में सतह के खिलाफ दबाव है । खींच माप संपर्क से बाहर लाने के लिए टिप से सब्सट्रेट दूर ले जाकर शुरू हो गया है. अगर कोई प्रोटीन शुरू में टिप के संपर्क में आता है, तो उसे खींचा जाएगा और विस्थापन के खिलाफ बल का खुलासा किया जाएगा । सब्सट्रेट फिर टिप के साथ संपर्क में वापस लाया जाता है और एक आराम ट्रेस मापा जाता है जहां प्रोटीन तह बल विस्थापन से निर्धारित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एक पॉलीप्रोटीन का उपयोग है, चरण 1.1.2 में वर्णित है, जो “फिंगरप्रिंट” एकल अणु की घटनाओं के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । आम तौर पर, पॉलीप्रोटीन प्रोटीन ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान mcb-१२४४२९७ और mcb-१५१७२४५ pem द्वारा समर्थित था ।
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
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