Приходите в сторону света: В Vivo мониторинг Pseudomonas aeruginosa биопленки инфекций, хронических ран в диабетической голые мышиных модели
Summary
Здесь мы описываем Роман Диабетическая мышиных модель, используя лысых мышей мониторинга в реальном времени, неинвазивный, биопленки раневые инфекции биолюминесцентных синегнойной палочки. Этот метод может быть адаптирована к инфекции других бактериальных видов и генетически измененных микроорганизмов, в том числе многовидового биопленки, оценить и протестировать эффективность стратегий antibiofilm.
Abstract
Считается, что наличие бактерий как структурированных биопленки в хронических ран, особенно у больных сахарным диабетом, предотвращения заживление ран и резолюции. Хронический мыши раны модели были использованы для понимания основных взаимодействий между микроорганизмы и принимающей. Модели, разработанные к настоящему времени полагаются на использование волосами животных и терминал сбора ткани раны для определения жизнеспособных бактерий. В то время как значительное понимание был накоплен с этими моделями, эта экспериментальная процедура требует большое количество животных и выборки отнимает много времени. Мы разработали Роман мышиных модель, которая включает несколько оптимальных инноваций для оценки биопленки прогрессирования хронической раны:) он использует лысых мышей, устраняя необходимость удаления волос; b) применяет предварительно сформированных биопленки на раны, позволяя для непосредственной оценки стойкости и эффект этих общин на узле; c) контролирует биопленки прогрессии, количественного определения света производства путем генной инженерии биолюминесцентных штамм Pseudomonas aeruginosa, позволяя мониторинг в реальном времени заражения, тем самым уменьшая количество животных, требуется для каждого исследования. В этой модели одной полную глубину раны производится на задней части СТЗ индуцированной сахарным диабетом лысых мышей и привиты с биопленки биолюминесцентных штамм P. aeruginosa Xen 41. Ежедневно в в естественных условиях изображений системы, позволяющие в естественных условиях и в situ быстрого биопленки визуализации и локализации биопленки бактерий в пределах раны записывается светоотдачи от ран. Этот новый метод является гибким, как он может использоваться для изучения других микроорганизмов, в том числе генетически модифицированных видов и многовидового биопленки и может иметь особое значение в тестировании анти биопленки стратегий, включая антимикробной окклюзионной повязки.
Introduction
Биоплёнки являются сложные сообществ микроорганизмов, внедренные в матрицу, полимерных веществ, которые выделены в качестве фактора для бедных решения хронических ран1. Изучение этих высокоорганизованных, постоянные микробного населения особенно важно для больных сахарным диабетом, где плохое кровообращение конечностей и изменены периферической сенсорной механизмы привести к незамеченными поражений2. Согласно оценкам, в Соединенных Штатах, что 15% больных сахарным диабетом будет развиваться по крайней мере один из желудка в течение их жизни. Это приводит к экономических расходов около 28 млрд долларов на лечение3,4, не упоминать immensurable эмоциональное и социальное бремя. Понимание факторов, которые позволяют микробных сообществ упорствовать в рану кровать и то влияние, которое эти биоплёнки имеют в лечебных мероприятий необходимо управлять лучший уход для пострадавших пациентов и стимулирования разработки новых подходов к лечению. Таким образом создание воспроизводимых и переводимых в vivo моделей для изучения взаимодействия бактерий хост имеет первостепенное значение.
Мышиных моделях была успешно разработана для изучения влияния биопленки в хронических ран. Однако, эти модели, часто используют волосатая видов и оценивать биопленки Распродажа, плиты счетчики для жизнеспособных бактериальных клеток подакцизным ткани от жертвенных животных, делая их трудоемким и дорогостоящим.
Биофотонный альтернативой конечной точки выборки животных в оценке инфекции была впервые предложена КОНТАГ и др. (1995) 5 , кто разработал метод для захвата люминесценции от конститутивно биолюминесцентных Salmonella typhimurium для измерения эффективности лечения антибиотиками. Другие исследования, воспользовавшись биолюминесценции излучающих бактерий последовали за. К примеру, предлагает и др. (2001) 6 проверка инфекции модель для изучения бедра инфекции Escherichia coli у мышей путем измерения люминесценции с помощью активизации зарядовой и позднее, Kadurugamuwa и др. (2003) 7 воспользовался фотон, излучающие свойства инженерии штамма золотистого стафилококка , чтобы исследовать эффективность нескольких антибиотиков в катетер рану модели мышей.
Этот метод характеризуется здесь представляет простой протокол вызвать диабет в лысых мышей, производить и прививать раны с предварительно сформированных биолюминесцентных биоплёнки P. aeruginosa, и проводить мониторинг Биофотонный инфекции использование в vivo imaging системы. Он предлагает прямой, быстрого, в месте, неинвазивная и количественный процесс оценки биопленки в хронических ран и Кроме того, позволяет для дополнительного анализа, такие как микроскопических изображений заживление раны, прерывистый крови коллекции для цитокинов измерения и терминал ткани коллекции для гистологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем новую модель мыши для изучения биопленки в диабетической хронических ран, который имеет много преимуществ для создания воспроизводимых, переводимые и гибкие модели.
Первый инновации является использование лысых мышей. Другие мыши модели были разработан…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить за поддержку этой работы (Грант # #7-13-BS-180), Мичиганского государственного университета исследования технологии фонда поддержки для профессиональной подготовки и доступа к в vivo imaging системы американской ассоциации диабета и Мичиган государственного университета следственных гистопатология лаборатория для обработки мыши биопсии для гистопатологические осмотра.
Materials
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
Referências
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265 (2013).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge – a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
