प्रतिरोध धमनियों का एक सेल संस्कृति मॉडल, endothelium, चिकनी मांसपेशी, या endothelium और चिकनी मांसपेशी (myoendothelial जंक्शन) के बीच में संकेत रास्ते के विच्छेदन के लिए अनुमति का वर्णन किया गया है । एगोनिस्ट या प्रोटीन अलगाव, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के चयनात्मक आवेदन इस सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग कर उपयोग किया जा सकता है ।
myoendothelial जंक्शन (MEJ), छोटे व्यास प्रतिरोध धमनियों में एक अनूठा संकेत microdomain, विशिष्ट प्रोटीन और संकेतन प्रक्रियाओं है कि संवहनी टोन और रक्तचाप को नियंत्रित कर सकते हैं की स्थानीयकरण दर्शाती है । के रूप में यह या तो endothelial या चिकनी मांसपेशी सेल से एक प्रक्षेपण है, और इसके छोटे आकार के कारण (औसत पर, एक क्षेत्र के ~ 1 µm2), MEJ अलगाव में अध्ययन करने के लिए मुश्किल है । हालांकि, हम एक सेल संस्कृति मॉडल संवहनी कोशिका सह संस्कृति (VCCC) कहा जाता है कि के लिए अनुमति देता है विकसित किया है इन विट्रो MEJ गठन, endothelial सेल ध्रुवीकरण, और प्रतिरोध के संवहनी दीवार में प्रोटीन और प्रक्रियाओं संकेत के विच्छेदन धमनियों. VCCC आवेदनों की एक भीड़ है और विभिंन प्रकार के सेल सूट अनुकूलित किया जा सकता है । मॉडल दो सेल ०.४ µm pores जिसमें में इन विट्रो MEJs फार्म कर सकते है के साथ एक फिल्टर के विपरीत पक्षों पर हो प्रकार के होते हैं । यहां हम वर्णन कैसे कोशिकाओं और endothelial, MEJ, और चिकनी मांसपेशी भागों, जो तब प्रोटीन अलगाव या गतिविधि की परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की अलगाव की चढ़ाना के द्वारा VCCC बनाने के लिए । बरकरार सेल परतों के साथ फिल्टर, एंबेडेड, और immunofluorescent विश्लेषण के लिए खोदी तय किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, इस मॉडल से खोजों के कई बरकरार प्रतिरोध धमनियों का उपयोग कर पुष्टि की गई है, अपनी शारीरिक प्रासंगिकता रेखांकित ।
छोटे व्यास प्रतिरोध धमनियों में, एक पतली आंतरिक लोचदार लेमिना (IEL) endothelial (ईसी) और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी) अलग करती है । कोशिकाओं को इस लोचदार मैट्रिक्स में छेद के माध्यम से परियोजना और गैप जंक्शन चैनल1,2के माध्यम से प्रत्यक्ष cytoplasmic कनेक्शन कर सकते हैं । इस अनूठी संरचना myoendothelial जंक्शन (MEJ) का कार्यकाल है । MEJ एक छोटा है (लगभग ०.५ µm x ०.५ µm, संवहनी बिस्तर पर निर्भर करता है), सेलुलर प्रक्षेपण endothelial कोशिकाओं के मुख्य रूप से बना है, लेकिन चिकनी मांसपेशियों से उत्पंन कर सकते है के रूप में अच्छी तरह से3,4। जांचकर्ताओं के एक नंबर नेटवर्क है कि MEJ में चुनिंदा होते है संकेतन की अपार जटिलता का प्रदर्शन किया है, यह द्वि-endothelium और चिकनी मांसपेशियों के बीच सिग्नलिंग की सुविधा के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण स्थान प्रतिपादन5 ,6,7,8,9,10.
हालांकि, MEJ में रास्ते संकेत के एक यंत्रवत विच्छेदन एक बरकरार धमनी में मुश्किल है । क्योंकि MEJ एक सेलुलर प्रक्षेपण है, यह वर्तमान में संवहनी दीवार से एक vivo MEJ में अलग करने के लिए संभव नहीं है । इस कारण से, VCCC मॉडल1 विकसित किया गया था । महत्वपूर्ण बात, VCCC शारीरिक endothelial आकृति विज्ञान11 और सेल12के शिखर और MEJ भागों के बीच संकेतन के ध्रुवीकरण प्रतिकृति । यह इस अनूठी मॉडल है कि खोज की सुविधा है कि अल्फा हीमोग्लोबिन endothelial सेल में है, MEJ के लिए ध्रुवीकरण किया गया । यह पारंपरिक प्रसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के विपरीत है जो अल्फा हीमोग्लोबिन13एक्सप्रेस नहीं है । microvascular endothelium में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए, यह endothelial कोशिकाओं है कि VCCC में cultureed किया गया है का उपयोग करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है, विशेष रूप से अगर आशय टुकड़े संकेत रास्ते कि छोटे व्यास प्रतिरोध धमनियों में होने वाली है ।
सह संस्कृति के लिए छोटे व्यास pores (व्यास में ०.४ µm) के साथ एक फिल्टर युक्त एक तगड़ा प्लास्टिक डालने का प्रयोग दो अलग कक्ष प्रकार परतों के बीच पलायन से कोशिकाओं को रोकता है । यह कोशिकाओं के बीच एक 10 µm दूरी में परिणाम है, जो काफी लंबे समय से vivo मेंहै, लेकिन अभी भी vivo में कई MEJs की विशेषताओं, प्रोटीन स्थानीयकरण और दूसरा दूत सहित संकेतन1 प्रतिकृति , 14. इसके अलावा, VCCC एक एगोनिस्ट या विशिष्ट सेलुलर डिब्बे को प्रतिपक्षी के अलावा के माध्यम से सेल प्रकार विशेष संकेतन के लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, BAPTA के साथ चुनाव आयोग लोड-हूं कैल्शियम chelate के लिए, और phenylephrine के साथ एसएमसी उत्तेजक14। सह संस्कृति मॉडल के अंय विवरण के विपरीत15,16,17,18,19,20,21, यह प्रदान करता है mRNA और प्रोटीन फिल्टर के भीतर अलग MEJ अंश सहित के लिए अलग भिन्न पर निर्देश, pores. VCCC करने के लिए इस तकनीक के अलावा mRNA स्थानीयकरण या प्रतिलेखन में परिवर्तन की विशिष्ट जांच के लिए अनुमति देता है22, प्रोटीन फास्फारिलीकरण12,23, और प्रोटीन गतिविधि12। यह लेख नीचे पर फिल्टर और एसएमसी के शीर्ष पर चुनाव आयोग की चढ़ाना का वर्णन है, हालांकि यह संस्कृति के लिए संभव है दो अलग संरचनाओं11,18,24में कोशिका प्रकार ।
1. VCCC के लिए चढ़ाना कोशिकाओं संस्कृति बड़ी २२५ cm 2 में बाँझ शर्तों के तहत चुनाव आयोग और एसएमसी की कुप्पी ३७ & #176; C, जब तक 70-90% धाराप्रवाह । यह सुनिश्चित करें कि एसएमसी से अधिक ईसी का उपयोग किया जाए;…
VCCC इन विट्रो मेंrecapitulating MEJs के मामले में लाभ की एक संख्या है, लेकिन अगर VCCC विशिष्ट आवेदन के लिए उपयोग किया जा सकता है निर्धारित जब चर्चा के अंक हैं. उदाहरण के लिए, यदि इस मॉडल के साथ भिंन कक्ष प्रकारों का उपय?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान R01088554, T32HL007284 और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन डॉक्टरेट फैलोशिप 14PRE20420024 द्वारा समर्थित किया गया था । हम विशेष रूप से सेंट झड सेलुलर इमेजिंग साझा अनुसंधान कोर का धंयवाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए रान्डेल वेकफील्ड और लिंडा Horner सहित, एडम Straub प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के साथ सहायता के लिए, और उसके लिए Pooneh बाग पांडुलिपि प्रोटोकॉल पर बहुमूल्य प्रतिक्रिया ।
24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
225cm2 flask | Corning | 431082 | |
6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
50mL conical tube | Corning | 352070 | |
10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Embedding/Sectioning/Staining | |||
Paraffin | Fisher | P31-500 | |
Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
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sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
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Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
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Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
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2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
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Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
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1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |