Un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza
Summary
È descritto un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza, permettendo per la dissezione delle vie nell’endotelio, muscolo liscio, o tra endotelio e muscolo liscio (bivio myoendothelial) di segnalazione. L’applicazione selettiva di agonisti o isolamento della proteina, microscopia elettronica o immunofluorescenza può essere utilizzata usando questo modello della coltura cellulare.
Abstract
La giunzione di myoendothelial (MEJ), un unico microdomain segnalazione nelle arterie della resistenza di piccolo diametro, esibisce localizzazione di proteine specifiche e processi di segnalazione che possono controllare il tono vascolare e della pressione sanguigna. Come è una proiezione da entrambi la cellula endoteliale o del muscolo liscio e a causa della sua piccola dimensione (in media, un’area di ~ 1 µm2), il MEJ è difficile da studiare in isolamento. Tuttavia, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare chiamato vascolare delle cellule co-cultura (VCCC) che consente di in vitro MEJ formazione, polarizzazione delle cellule endoteliali e la dissezione dei processi nella parete vascolare di resistenza e proteine di segnalazione arterie. Il VCCC ha una moltitudine di applicazioni e può essere adattata a diversi tipi di cellule. Il modello è costituito da due tipi di cellule coltivati su lati opposti di un filtro con 0,4 µm pori in cui lo in vitro MEJs può formare. Qui descriviamo come creare il VCCC tramite placcatura delle cellule e l’isolamento di endoteliale, MEJ e frazioni di muscolo liscio, che quindi possono essere utilizzate per l’isolamento di proteine o attività saggi. Può essere fissato il filtro con strati di cellule intatte, embedded e sezionati per analisi immunofluorescente. Soprattutto, molte delle scoperte da questo modello sono stati confermati tramite arterie della resistenza intatto, sottolineando la rilevanza fisiologica.
Introduction
Nelle arterie della resistenza di piccolo diametro, una sottile lamina elastica interna (IEL) separa endoteliali (EC) e cellule muscolari lisce (SMC). Le cellule possono progetto attraverso i fori in questa matrice elastica e connessioni dirette citoplasmatico attraverso gap junction canali1,2. Questa struttura unica è definita il bivio di myoendothelial (MEJ). Il MEJ è un piccolo (circa 0,5 µm x 0,5 µm, a seconda della base vascolare), proiezione cellulare composto principalmente di cellule endoteliali ma può provenire dal muscolo liscio anche3,4. Un numero di investigatori hanno dimostrato l’immensa complessità di reti che si verificano in modo selettivo a MEJ, rendendolo un luogo particolarmente importante per facilitare la segnalazione di bi-direzionale tra endotelio e muscolo liscio5 di segnalazione ,6,7,8,9,10.
Tuttavia, una dissezione meccanicistica di vie di segnalazione presso il MEJ è difficile in un’arteria intatta. Perché il MEJ è una proiezione cellulare, non è attualmente possibile isolare un in vivo MEJ da parete vascolare. Per questo motivo, è stato sviluppato il modello VCCC1 . D’importanza, il VCCC replica fisiologica morfologia endoteliale11 e polarizzazione di segnalazione tra l’apicale e MEJ porzioni della cella12. Era questo modello unico che hanno facilitato la scoperta che l’emoglobina alfa è in cellule endoteliali, polarizzata per il MEJ. Questo è in contrasto con le cellule endoteliali convenzionalmente coltivate che non esprimono emoglobina alfa13. Per i ricercatori interessati a endotelio microvascolare, può essere più opportuno utilizzare le cellule endoteliali che sono state coltivate in VCCC, particolarmente se l’intento è quello di sezionare le vie di segnalazione che si verificano nelle arterie della resistenza di piccolo diametro.
Usando un robusto inserto in plastica contenente un filtro con pori di diametro piccolo (0,4 µm di diametro) per tipi distinti delle cellule co-coltura due impedisce che le cellule migrano tra strati. Il risultato è una distanza di 10 µm tra le cellule, che è significativamente più lungo di in vivo, ma ancora molte delle caratteristiche in vivo di MEJs, tra cui la localizzazione della proteina e secondo messaggero segnalazione1 replica , 14. Inoltre, la VCCC consente per il targeting di cella specifica del tipo di segnalazione tramite l’aggiunta di un agonista o antagonista al compartimento cellulare specifico. Ad esempio, caricando la CE con BAPTA-AM di chelato del calcio e stimolando la SMC con fenilefrina14. A differenza di altre descrizioni di co-coltura modelli15,16,17,18,19,20,21, questo fornisce istruzioni su come isolare le frazioni distinte per mRNA e proteine, tra cui la frazione MEJ distinta all’interno dei pori del filtro. L’aggiunta di questa tecnica per il VCCC permette per indagine specifica dei cambiamenti nella localizzazione di mRNA o trascrizione22, fosforilazione della proteina12,23e proteina attività12. Questo articolo descriverà placcatura della CE in cima al filtro e SMC sul fondo, anche se è possibile alla cultura due tipi cellulari differenti conformazioni11,18,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il VCCC ha una serie di vantaggi in termini di ricapitolare MEJs in vitro, ma ci sono punti di discussione quando si determina se il VCCC può essere utilizzato per applicazioni specifiche. Ad esempio, se diversi tipi di cellule devono essere usati con questo modello, esso sarà necessario essere ottimizzato. Abbiamo usato cellule umane primarie, ma è possibile isolare le cellule da bovino aorte24, o topi wildtype o ad eliminazione diretta, e li usa a VCCC1,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, polmone ed Istituto del sangue concede 14PRE20420024 fellowship predoctoral R01088554, T32HL007284 e American Heart Association. Ringraziamo in particolare la St. Jude cellulare Imaging ha condiviso la ricerca Core, tra cui Randall Wakefield e Linda Horner per le immagini di microscopia elettronica, Adam Straub per assistenza con immagini rappresentative di immunofluorescenza e Pooneh Bagher per lei prezioso feedback sul protocollo manoscritto.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
Referências
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