Hücre kültür manken direnç arter
Summary
Hücre kültür manken direnç arter yollar endotel, düz kas, veya endotel ve düz kas (myoendothelial junction) arasında sinyal diseksiyon için izin açıklanmıştır. Bu hücre kültür model kullanarak agonistler veya protein yalıtım, elektron mikroskopi veya ayirt seçici uygulama yararlı olabilir.
Abstract
Myoendothelial kavşak (MEJ), küçük çaplı direnç arterler içinde benzersiz bir sinyal microdomain yerelleştirme spesifik proteinlerin ve vasküler sesi ve kan basıncı kontrol edebilirsiniz sinyal süreçlerin sergiler. Bu da bir projeksiyon endotel veya düz kas hücresi ve küçük nedeniyle (ortalama olarak, bir alan ~ 1 µm2), MEJ boyutu gibi yalıtım modunda çalışmaya zordur. Ancak, vitro MEJ oluşumu, endotel hücre polarizasyon ve proteinler ve süreçleri direnç damar duvarındaki sinyalizasyon disseksiyonu sağlar vasküler hücre ortak kültürü (VCCC) denilen bir hücre kültür modeli geliştirdik arterler. VCCC uygulamalar vardır ve farklı hücre türleri uygun şekilde uyarlanabilir. Model içinde vitro MEJs oluşabilir 0.4 µm gözenekli filtre karşı taraflarında yetiştirilen iki hücre tipleri oluşur. Burada VCCC yolu ile endotel, izolasyon ve kaplama hücre oluşturmak nasıl açıklamak MEJ ve daha sonra protein yalıtım veya etkinlik için kullanılabilir düz kas kesirler deneyleri. Katıştırılmış ve kesitli immünfloresan analiz için filtre sağlam hücre katmanları ile düzeltilebilir. Önemlisi, birçok buluşlar bu modelden sağlam direnç arterler, fizyolojik önemini vurgulamış kullanarak teyit edilmiştir.
Introduction
Küçük çaplı direnç arterlerde endotel (EC) ve düz kas hücreleri (SMC) bir ince iç elastik lamina (IEL) ayırır. Hücreler bu elastik matris deliklerden proje ve doğrudan sitoplazmik bağlantı yolu ile gap junction kanal1,2. Bu eşsiz yapının myoendothelial Kavşağı (MEJ) olarak adlandırılır. MEJ küçük (yaklaşık 0.5 µm vasküler yatağın bağlı olarak 0.5 µm x), hücresel projeksiyon ağırlıklı olarak endotel hücreleri oluşur fakat düz kas de3,4kaynaklı. Müfettişler bir dizi seçmeli olarak endotel ve düz kas5 arasında çift yönlü sinyal kolaylaştırmak için özellikle önemli bir konuma işleme MEJ oluşan ağlar sinyal büyük karmaşıklığı göstermiştir ,6,7,8,9,10.
Ancak, sinyal yolları MEJ, mekanik bir diseksiyon sağlam bir arter zordur. MEJ hücresel bir projeksiyon olduğundan, şu anda bir vivo içinde MEJ damar duvarından izole etmek mümkün değil. Bu nedenle, VCCC model1 geliştirilmiştir. Önemlisi, VCCC fizyolojik endotel Morfoloji11 ve apikal arasında sinyal polarizasyon çoğaltır ve hücre12MEJ bölümleri. Endotel hücre, MEJ için polarize olan alfa hemoglobin keşif kolaylaştırdı bu benzersiz model oldu. Alfa hemoglobin13ifade değil geleneksel kültürlü endotel hücreleri aksine bu. Araştırmacılar mikrovasküler endotel baktılar, özellikle niyet küçük çaplı direnç arterlerde oluşan sinyal yolları incelemek için ise VCCC, kültürlü endotel hücreleri kullanmak daha uygun olabilir.
Sağlam bir plastik eklemek küçük çaplı gözenekleri (çapı 0.4 µm) olan bir filtre içeren ortak kültür iki farklı hücre tipleri için kullanarak hücrelerin katmanlar arasında geçiş engeller. 10 µm mesafe içinde vivoönemli ölçüde daha uzun, ama hala MEJs protein Yerelleştirme ve ikinci haberci1 sinyal de dahil olmak üzere, in vivo özelliklerinin çoğunu çoğaltır hücreleri arasındaki sonuçlar , 14. Ayrıca, hücre türüne özgü bir agonist veya antagonisti belirli hücresel yuvası eklenmesi ile sinyal hedefleme için VCCC sağlar. Örneğin, EC kalsiyum şelasyon yapın için BAPTA-AM ile yükleme ve SMC phenylephrine14ile uyarıcı. Aksine diğer açıklamalar ortak kültür modelleri15,16,17,18,19,20,21, bu sağlar mRNA ve protein, filtre gözenekleri içinde farklı MEJ kesir dahil olmak üzere farklı kesirler yalıtma hakkında talimatlar. MRNA yerelleştirme veya transkripsiyon22, protein fosforilasyon12,23ve protein etkinlik12değişiklikler belirli incelenmesi için bu teknik için VCCC eklenmesini sağlar. İki hücre tipleri farklı biçimler11,18,24yılında kültür mümkündür ancak bu makalede EC filtre ve SMC üstünde tepe-in alt kaplama anlatacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
VCCC MEJs vitrorecapitulating açısından avantajları vardır, ama eğer VCCC-ebilmek var olmak kullanmak için belirli uygulama belirlerken tartışma noktaları vardır. Örneğin, farklı hücre türleri bu model ile kullanılmak üzere olduğunda optimize gerekir. Biz birincil insan hücreleri kullandık ama sığır aortas24veya wildtype ya da nakavt fareler hücreleri izole ve VCCC1,5,14‘…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal kalp tarafından desteklenmiştir, akciğer ve kan Enstitüsü R01088554, T32HL007284 ve Amerikan Kalp Derneği HGUGM bursu 14PRE20420024 verir. Biz özellikle St. Jude hücresel görüntüleme paylaşılan araştırma Randall Wakefield ve Linda Horner elektron mikroskobu görüntüler için Adam Straub temsilcisi ayirt görüntüleri hakkında yardım almak için ve onun için Pooneh Bagher dahil olmak üzere çekirdek, teşekkür el yazması Protokolü değerli geribildirim.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
Referências
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix?. Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
