Un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia
Summary
Se describe un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia, lo que permite la disección de la señalización de vías en el endotelio, músculo liso, o entre el endotelio y músculo liso (el cruce de myoendothelial). Puede utilizar la aplicación selectiva de agonistas o aislamiento de la proteína, microscopia electrónica o inmunofluorescencia usando este modelo de cultura de célula.
Abstract
La ensambladura de myoendothelial (MEJ), un único microdomain señalización en arterias de resistencia de pequeño diámetro, exhibe la localización de proteínas específicas y procesos de señalización que controlan el tono vascular y la presión arterial. Ya que es una proyección desde la célula endotelial o músculo liso y gracias a su pequeño tamaño (en promedio, un área de ~ 1 μm2), lo MEJ es difícil estudiar en aislamiento. Sin embargo, hemos desarrollado un modelo de cultura de célula llamado vascular co cultivo celular (VCCC) que permite en vitro formación MEJ, polarización de la célula endotelial y la disección de la señalización de las proteínas y los procesos de resistencia de la pared vascular arterias. El VCCC tiene multitud de aplicaciones y se pueden adaptar a diferentes tipos de células. El modelo consiste en dos tipos de células cultivados en lados opuestos de un filtro con poros de μm 0,4 en el que los de vitro MEJs puede formar. Aquí describimos cómo crear VCCC mediante placas de células y el aislamiento de endotelial, MEJ y fracciones de músculo liso, que pueden utilizarse para aislamiento de proteína o actividad ensayos. El filtro con capas de la célula intactas puede ser fijas, encajado y seccionado para análisis inmunofluorescente. Lo importante es que, muchos de los descubrimientos de este modelo han confirmado mediante las arterias de resistencia intacta, subrayando su importancia fisiológica.
Introduction
En arterias de resistencia de diámetro pequeño, una delgada Lámina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) y células de músculo liso (SMC). Las células pueden proyectar a través de agujeros en esta matriz elástica y hacer conexiones citoplásmicas directas via gap junction canales1,2. Esta estructura única se denomina al cruce myoendothelial (MEJ). El MEJ es un pequeño (aproximadamente 0,5 μm x 0,5 μm, dependiendo de la cama vascular), proyección celular integrado predominante por las células endoteliales pero puede originar de músculo liso así como3,4. Un número de investigadores ha demostrado la inmensa complejidad de señalización a redes que ocurre selectivamente en el MEJ, haciéndola un lugar especialmente importante para facilitar la señalización bidireccional entre endotelio y músculo liso5 ,6,7,8,9,10.
Sin embargo, es difícil en una arteria intacta una disección mecanicista de vías de señalización en el MEJ. Porque lo MEJ es una proyección celular, no es actualmente posible aislar un en vivo MEJ de la pared vascular. Por esta razón, se desarrolló el VCCC modelo1 . Lo importante, el VCCC Replica fisiológica morfología endoteliales11 y polarización de la señalización entre el apical y MEJ porciones de la célula12. Fue este modelo único que facilitó el descubrimiento de que la hemoglobina alfa es en la célula endotelial, polarizó a la MEJ. Esto está en contraste con las células endoteliales cultivadas convencionalmente que no expresan alfa hemoglobina13. Para los investigadores interesados en el endotelio microvascular, puede ser más apropiado utilizar las células endoteliales que han sido cultivadas en el VCCC, particularmente si la intención de diseccionar las vías de señalización que ocurren en las arterias de resistencia de diámetro pequeño.
Mediante un inserto de plástico resistente que contiene un filtro con poros de diámetro pequeño (0,4 μm de diámetro) a tipos de células distintas de cultura Co dos impide que las células migran entre capas. Resulta en una distancia de 10 μm entre las células, que es significativamente mayor que en vivo, pero todavía muchas de las características en vivo de MEJs, incluyendo localización de la proteína y segundo mensajero señalización1 Replica , 14. Además, el VCCC permite la selección de células específicas del tipo de señalización mediante la adición de un agonista o antagonista del compartimiento celular específica. Por ejemplo, cargando la CE con BAPTA-AM quelar calcio y estimulando el SMC con fenilefrina14. En contraste con otras descripciones de co-cultivo modelos15,16,17,18,19,20,21, esto proporciona instrucciones de aislar las distintas fracciones de mRNA y proteína, incluyendo la fracción MEJ distinta dentro de los poros del filtro. La incorporación de esta técnica la VCCC permite la investigación específica de los cambios en la localización de mRNA transcripción22proteína phosphorylation12,23y proteínas actividad12. Este artículo describe una galjanoplastia de la CE en la parte superior del filtro y SMC en la parte inferior, aunque es posible cultivar los dos tipos celulares en diferentes conformaciones11,18,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
El VCCC tiene una serie de ventajas en términos de Recapitulando MEJs en vitro, pero hay puntos de discusión para determinar si el VCCC puede ser utilizado para aplicaciones específicas. Por ejemplo, si diferentes tipos de células se utilizan con este modelo, tendrá que ser optimizado. Hemos utilizado células humanas primarias pero es posible aislar células de aortas bovinas24o ratones de tipo salvaje o el agujero ciego, y utilizarlos en el VCCC1,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el National Heart, Lung and Blood Institute otorga R01088554, T32HL007284 y American Heart Association 14PRE20420024 de beca predoctoral. Agradecemos especialmente el St. Jude celular imagen compartida investigación núcleo, incluyendo Randall Wakefield y Linda Horner para las imágenes de microscopía electrónica, Adam Straub ayuda con imágenes representativas de la inmunofluorescencia y Pooneh Bagher para ella valiosos comentarios sobre el protocolo de manuscrito.
Materials
| 24mm diameter, 0.4µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225cm2 flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10X Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10X Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1X PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
Referências
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